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令和2年度は、前年度において①出芽酵母において見出された新規の5’末端構造の構造解析と②tRNA前駆体の脱キャップに関わる可能性が示唆された複数の脱キャップ酵素の生化学的な解析を行うための組換えタンパク質の取得に注力した。
① 新規5’末端構造の構造解析：質量分析による解析から新規5’末端構造はX capが付加されたものであることが判明し、X cap構造との違いはキャップ構造とRNAの1塩基目を繋ぐリン酸基の数であることが判明した。実際に、X cap付加酵素と転写合成した当該RNAをin vitroにおいて反応させたところ、同様の末端構造が形成されることが確認された。
②脱キャップ酵素組換えタンパク質の取得：真核生物には複数の脱キャップ酵素が存在しておりそれらの5’末端構造の認識機構および反応機構を明らかにすることは、RNA 5’末端構造の制御機構の理解に繋がる重要な課題であり、RNAの5’末端構造に基づいた分画を行う際の有効なツールとなる酵素の発見が期待される。前年度においてtRNA前駆体の5’キャップ修飾の分解に関わることが示唆された脱キャップ酵素の生化学的な特性を明らかにするため、大腸菌発現系を用い各酵素の組換え体タンパク質を取得した。次いで、取得した酵素の脱キャップ活性を調べるため、抗キャップ抗体を用いたノースウェスタンによる酵素活性の評価を行った。しかしながら、どの酵素においても脱キャップ活性が確認されなかった。原因として大腸菌から精製する過程で失活した可能性が考えられたため、発現条件や精製条件を改善した上で再度精製しアッセイを行う予定である。また、ノースウェスタンではなく質量分析など別の検出系による評価を行うことも検討している。
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