| 研究課題/領域番号 |
19K22417
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
川上 厚志 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (00221896)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| キーワード | 組織再生 / ゼブラフィッシュ / ヒレ / レチノイン酸 |
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| 研究実績の概要 |
魚類や両生類など脊椎動物の一群は高い組織再生能を持つ。種による再生能の差異のメカニズムを明らかにすることで，組織恒常性の普遍原理の解明や再生医療などへの展開が期待される。
私達は，化合物スクリーニングから，レチノイン酸受容体RARβアゴニストを同定した。レチノイン酸（RA）アゴニストは，劇的な効果を示し，幼生でも成体でも，短時間の処理で再生を不可逆的に完全停止させ，ほ乳類組織のように再生不能に変化させた。また，アゴニストは，どの再生ステージで投与しても再生を停止させ，さらに，再生が停止した組織は，傷を与えることで，再び再生を開始した。これらの結果は，RAシグナルが，再生の可否を決定するシグナルとして作用することを示唆している。
RAシグナルは，よく研究されてきたシグナルの一つであり，四肢発生において必須であることが示されている一方で，再生でのRAシグナルの役割は，骨の過剰な形成などの異常を起こすことも報告されており，実は明瞭でない。細胞内RA濃度は，Raldhによる合成反応とCyp26による分解反応のバランスで決まるが，Cyp26自身はRAシグナルの転写標的遺伝子のひとつであり，ネガティブフィードバックによってRAを分解する。つまり，投与実験などで， RAシグナルはON・OFFのどちらの状態なのか疑問である。
本年度の研究では，再生におけるRAシグナル作用を再検証し，RARアゴニストによる組織再生の停止はRAシグナルの活性化または抑制化のどちらによっているのかを解明した。Cyp26:YFPトランスジェニックを用い，RARアゴニストおよび様々の作用を検討した結果，再生停止は，Cyp26の強く長いネガティブフィードバックが起こることにより，RAシグナルが低下していることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
私達が化合物スクリーニングから同定したレチノイン酸受容体RARβアゴニストは，幼生でも成体でも，再生を不可逆的に完全停止させ，ほ乳類組織のように再生不能に変化させた。細胞内のRA濃度は， Raldhによる合成反応とCyp26による分解反応のバランスで決まるが，Cyp26自身はRAシグナルの転写標的遺伝子であり，ネガティブフィードバックによってRAを分解する。従って，RARアゴニスト投与により，RAシグナルはON・OFFのどちらの状態なのか不明である。また，従来のRA投与実験やノックダウンなどでも，Cyp26aを介したネガティブフィードバックの作用やRAシグナルの活性化状態が詳細に検証されていなかい。
本研究では，RARアゴニストによる組織再生の停止はRAシグナルの活性化または抑制化のどちらによっているのかを検証するため，Cyp26aトランスジェニック（Tg）ゼブラフィッシュを用いたライブイメージングにより，RAシグナルの状態を検証した。ヒレ組織を切断し，再生過程でRARアゴニスト，Cyp26a阻害剤，様々のRA中間体・代謝体などの投与を行い，Cyp26活性化によってフィードバックの強さを検証した。
その結果，RARアゴニストやCyp26阻害剤，さらに，幾つかのRA代謝産物は，いずれもCyp26発現をしたが，発現誘導の強さはそれぞれに異なり，RARアゴニストは最も強く，長くCyp26を誘導した。さらに，一定の閾値以上のCyu26誘導が起こると，ヒレ組織の再生が停止することもわかった。RA代謝物の中には，比較的弱くしかCyp26の誘導を起こさず，その場合，再生も停止しなかった。以上から，RARアゴニストは，Cyp26を強力に長く誘導することにより，RAシグナルをシャットダウンしていることが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の目標は，再生におけるRAシグナル作用を再検証し，そしてさらに,下流で活性化または抑制化される遺伝子の探索から，再生の可否決定因子の同定を目指すことである。今後の研究は以下の項目について進める。
（1）RA代謝物による再生停止のレスキュー： これまでの研究で，RARアゴニストは極めて強く長いCyp26発現を誘導するが，RA代謝物のうち催奇形性の高い幾つかは，投与後，短期間でCyp発現は低下し，再生自体を阻害することはなかった。このことから，RARアゴニストはCyp26によって分解されないために，長期にRAシグナルを抑制するのではないかと予想している。従って，RARアゴニストによっていったん再生が停止した組織も，適切なタイミングと量のRAシグナルを入れてやることによって，再び再生が始まる可能性が考えられる。そこで，RARアゴニストで一過的に処理して再生芽停止したヒレに，Cyp26 Tgを用いてCyp26の発現量をモニターしながら，様々の条件でRAや代謝中間体を投与して，再生停止のレスキューを試みる。
（2）RA下流で働く，再生可否決定因子の探索：RAシグナルは核内受容体を経て直接に転写に作用する。RAアゴニストによって，正または負に制御される遺伝子は，再生の可否を決めるエッセンシャルな分子と予想される。RNAシーケンスにより，このプロセスに関わる遺伝子の探索を行う。
（3）再生可否決定因子の検証： 上で同定した候補遺伝子をそれぞれ，熱誘導プロモーター下に挿入してTgを作製し，強制発現によって，アゴニストによる再生停止をレスキューできるか検証する。さらに，レスキューに成功した場合，同様の手法で，ツメガエルやほ乳類など，四肢が再生できない動物で強制発現させて，再生を誘導できるかどうか試みる。また，ケミカルを用いてRAシグナルのレベルを操作して，アゴニストによる再生停止のレスキューや他の動物で再生誘導が可能かどうか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度の研究で，RNAシーケンスによる分子基盤の探索を計画していたが，RARアゴニストによって再生停止が起こる場合のメカニズムの検証で，想定外の実験や時間が必要だったため，2年目以降に行うことにした。2年目は，RNAシーケンスなどの探索を進める予定である。また，標的遺伝子候補の同定から，強制発現トランスジェニックの作製を大規模に進める。
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