| 研究課題/領域番号 |
19K22418
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
増田 真二 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (30373369)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| キーワード | Mesh1 / ショウジョウバエ / ppGpp / 緊縮応答 / NADPH |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ショウジョウバエを主な材料とし、未知の動物型ppGpp合成酵素遺伝子を単離すると共に、ショウジョウバエの視細胞におけるppGppの機能を詳細に調べることで、既知のラパマイシン標的タンパク質(TOR)やインスリン様成長因子(IGF)のシグナルとは独立した、動物の新たな恒常性維持・栄養応答機構の存在を実験的に証明することを目的に研究を進めている。今年度の実績を以下に記す。
ショウジョウバエMesh1タンパク質の解析：試験管内でppGpp分解活性を示す酵素Mesh1は、近年NADPH脱リン酸化酵素として機能することも報告された。つまりMesh1変異体で見られる表現型が、ppGpp分解活性の欠失によるものなのか、それともNADPHの脱リン酸化活性の欠失によるものなのかが不明であることを示唆している。この点を明らかにするために、NADPHの脱リン酸化活性を欠失しているが、ppGpp分解活性は失わないMesh1変異タンパク質を作出することを目指した。結晶構造より、Mesh1がNADPHと相互作用する際に重要と思われたアミノ酸（W138, R142）それぞれに部位特異的変異を導入したタンパク質（W138FおよびR142T）の精製に成功した。またゲノム編集技術によりそれらの変異をゲノムにもつショウジョウバエ変異体の作出に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
酵素の精製が非常に困難であったため、酵素活性測定を行うために必要な量を確保するのに時間がかかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、前年度までに精製に成功したショウジョウバエMesh1タンパク質のW138FおよびR142T変異タンパク質の生化学的解析を進める。具体的には、それぞれの変異体のppGppおよびNADPHに対する基質親和性を詳細に精査することで、それぞれのアミノ酸の機能と、その変異が酵素活性と基質認識に及ぼす影響する明らかにする。またゲノム編集技術によりそれらの変異をゲノムにもつショウジョウバエ変異体の生理学的解析を進める。最近他の研究グループが、ショウジョウバエのMesh1変異体は睡眠が不全になることを報告した。そこでこれら変異体の睡眠に対する影響を調べる。最終週的に、それらの変異タンパク質の酵素活性とそれらの変異体の表現型を比較し、NADPHもしくはppGppに対するMesh1依存の脱リン酸化活性の機能を明らかにしてゆく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予定していた実験に必要な組換え体の作出が遅れ、試薬の購入を次年度に持ち越すことが必要になったため。
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