2020 年度実施状況報告書

イセエビ幼生が平面構造から３D形態へ変化する原理の解明

研究課題

研究課題/領域番号	19K22428
研究機関	大阪大学
研究代表者	近藤滋大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (10252503)
研究期間 (年度)	2019-06-28 – 2022-03-31
キーワード	イセエビ / 幼生 / 脱皮 / フィロゾーマ / クチクラ
研究実績の概要	前年に、約2個体の最終齢幼生のサンプルを得て、クチクラの形状の解析を行った。しかし、クチクラに目だった折り畳みは発見されず、変形の原因解明には至らなかった。そのため、今年度は、もっと多数の、脱皮途中のサンプルを入手すべく、前年度よりも、ふぃろざーまの飼育環境の改善に努めた。協力してくれている三重県水産研が資金不足であるため、研究費の多くを、フィロゾーマの飼育を行う大型回転水槽とポンプに使わせていただいた。装置の改善と、研究協力鎖の献身的な作業により、2020年度の年明けから、かなりの数のフィロゾーマが育ち、サンプル収集が可能な状態になった。最も必要なサンプルは、脱皮直前、脱皮の前半期、脱皮の後半期、脱皮直後（プエルルス）である。それぞれを最低2個体づつ確保することを目的に、三重に出張し、脱皮変態する個体を順次固定した。現在までに少なくとも、直前の個体２，変態期前期と後期が数個体ずつ、直後の個体３を採集することに成功している。これらは順次、CTと電顕により形態を詳細に観察し、その結果を物理シミュレーションで解析することで、変形の原理を探っていく（来年度の予定）また、脱皮途中の個体を、拡大してライプ撮影することで、おおよその変化の過程を推定することができた。一番意外だったのは、脱皮直後のプエルルスの外殻が、成熟したもののように薄板になっておらず、厚みのある曲面になっていることであった。これまでクチクラの変形は、主に折り畳みの展開によって起こっていると仮定して研究を進めてきたが、それに加えて、厚みの変化（それと同時に起きる延展）を考慮する必要があることが解った。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初から最も危惧されたのは、脱皮途中のサンプルを手に入れられるかどうかであった。2019年度は、飼育状態が極めて悪く、水産研全体でも、2匹しか変態個体を得られないというひどい状態であり、その中でもその2個体をいただくことができたのは、幸運であった。不作の原因は、野生動物であるため、解っていない。幸い、２０２０年度の飼育により、少なくとも最低限の数は手に入れることができたので安堵している。今年のサンプルで、脱皮過程の個体を、拡大撮影することができ、その画像から、大まかな変形のプロセスの予想がついたことが、重要である。フィロゾーマは、頭部、胸部、腹部が分離しており、頭部は胸部の前方に存在する。また両者は、頭部と胸部が重なった領域にある口の部分でつながっている。しかし、プエルルスになると、胸部と頭部が一体化する。フィロゾーマの頭部が背側に、胸部が腹側になることで、前後の並びが背腹の並びになる。この過程で、接続部の形態がどのようになるのかが、今後の形態変化の理解にきわめて重要であろう。変態途中のサンプルは複数確保しているので、そのあたりを重点的にして画像解析を行いたい。サンプルはある程度確保されたが、今後もそれが供給される可能性が少ないことが解っている。三重県が、イセエビ研究の終止を決めたため、今後、フィロゾーマの飼育は行われない。現在手に入れたサンプルのみで、これからの解析を終わらせる必要があるため、サンプルは、複数の解析（電顕、CT、ミクロトーム）に使えるように、注意深く使っていく予定である。
今後の研究の推進方策	サンプルが得られたので、今後は、変態過程の各ステップにおける３Dデータの取得と、そのデータに基づいた変態原理の解明を進める。まず、マイクロCTにより、全体の３Dデータを取得し、変態における大まかな変形の概要を知る。特に、頭部と胸部の位置関係が、前後から背腹に移行する過程が重要であり、できればその過程を、CGで再現することを目的としたい。次に、マイクロCTにかけたサンプルをそのまま使い電顕により、より詳細な形態データを取得する。マイクロCTの解像度では、クチクラ表面の細かい形状は完治することができない。しかし、細かい形状は、クチクラにおける「位置」の基準点となる。変態過程で、それらの基準点の間の距離の変化を測定することで、クチクラの伸びと縮みを観測できるはずである。最期に、CTや電顕に使用していないサンプルを使い、連続凍結切片画像の再構成により、クチクラではなく、クチクラを分泌する上皮細胞層の形態データを取得する。変態期のクチクラは非常に薄く、また、クチクラそのものには、異方性の収縮をもたらす物理力が見いだせない。そのため、物理力の発生には、細胞の中にあるアクチン収縮が関与している可能性を考えている。そのため、Fアクチンをファロイジン等で染色可視化することで、その配向を知り、変形の力として働いているかどうかを確認する。上記の実験結果から、数理モデルを作り、変態の過程を計算機上で再現することが最終的目標である。数理モデルに関しては、変形の主要因が、折り畳みの展開であるか、あるいは伸展と収縮であるか、あるいはそれ以外であるかにより異なってくるため、現時点では数理モデルづくりは開始していない。しかし、折り畳みの場合には既にカブトムシのプロジェクトで作成したモデルを使うことができるし、進展と収縮の場合も、同じプログラムを改変することで対応できるので、準備は整っている。
次年度使用額が生じた理由	2019年度に、サンプル提供で協力している三重水産研究所における飼育状況が悪化し、ほとんどイセエビ幼生が育たないという状況が発生した。そのため、変態過程のサンプルを入手することがほとんどできず、形態の観察の実験を行うことができなかったため、予算の執行が遅れた。その間は、水産研究所に何度か滞在し、飼育装置の改良、購入を行うことで、次年度の研究が遂行できるように努めた。その甲斐があって、2020年度には、ある程度必要数の変態過程のサンプルを取得することができたので、本来の解析を行える状況になっている。2021年度に、それらのサンプルを使い精力的に研究を進めることで、計画していた実験の全てが行える予定なので、予算の執行も速やかに進むと考えている