研究課題
申請者らは脂質の超微局在を明らかにすることが、膜脂質の機能を解明するために必須であると考え、そのための方法開発に注力してきた。その結果、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法（QF-FRL: Quick Freezing & Freeze-fracture Labeling）によって膜脂質を特異的に標識することが可能であることを示し、生体膜脂質の二次元的分布をナノレベルで定量的に解明することに成功した。このQF-FRL法が識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、膜脂質の多様性のもう一つの要因である“疎水性尾部”の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。本研究では、現在用いているQF-FRL法をさらに改良することにより、凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに改良し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析することを可能にする。哺乳類培養細胞あるいは培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、そしてクリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することができた。標識方法を確立するために、まず蛍光標識法で行い光学顕微鏡を用いて解析し、最適な条件を確定した。具体的には、市販されているアルキン化オレイン酸（１価不飽和脂肪酸）を用いて培養細胞において蛍光標識することに成功した。アルキン化オレイン酸を哺乳類培養細胞に取り込ませた後、アルデヒドで固定しbiotin-azideと反応させることにより、蛍光標識を得ることができた。ラット膵臓の培養組織における不飽和脂肪酸の標識には、培養細胞と同様の方法を用い、外来性に投与した不飽和脂肪酸の蛍光標識の条件検討を行い、不飽和脂肪酸の標識ができる条件を見出すことができた。
3: やや遅れている
当初、計画していた培養細胞および組織標本において、アルキン化不飽和脂肪酸を培養液中に入れて、細胞あるいは組織細胞内に取り込ませた後、蛍光標識法によって、細胞内での不飽和脂肪酸の局在を観察することに成功した。また、当初の計画であった、アルキン化不飽和脂肪酸を取り込ませた培養細胞を急速凍結し、凍結割断レプリカを作成して、レプリカ膜上での不飽和脂肪酸の標識を電子顕微鏡を用いて不飽和脂肪酸の局在を観察する条件検討をしたが、最適な条件を見出しすることができず、レプリカ上で脂肪酸の標識をすることができなかった。
今後の研究では、脂肪酸分布解析技術開発のため、脂質の脂肪酸領域を露出することができる凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発・確立する。基本的に従来の急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を応用し、凍結割断後、エッチングすることでリン脂質の親水性頭部に面した氷を昇華させることにより親水性頭部を露出させる。その後、白金と炭素を蒸着すると疎水性の脂肪酸がむき出しになったレプリカ薄膜が形成される。レプリカ膜上での脂肪酸標識にはクリックケミスストリー法を用いて、脂肪酸をレプリカ膜上で標識することができる最適条件を検討する予定である。
脂肪酸の微細分布を観察する際に用いる、急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法では、培養細胞を加圧凍結装置が不可欠であったが、不具合があったためしばらくの間使用が困難な状況にあった。そのため、QF-FRL法によるレプリカ膜上での脂肪酸標識が出来なかったため、助成金の不使用分が生じた。現在は加圧凍結装置の修理を行い、不具合も解消したために、QF-FRL法による脂肪酸のナノスケールでの分布解析も可能となり、今後研究を推進していく。
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