| 研究課題/領域番号 |
19K22435
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
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| 研究分担者 |
正谷 達謄 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (70614072)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| キーワード | 電子顕微鏡 / 脂質 |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類培養細胞を加圧凍結するために、薄い金箔の上に細胞を培養した。次に、培養液にアルキン化オレイン酸などの各種アルキン化脂肪酸を入れ、一昼夜細胞培養することにより、生体膜の脂肪酸を代謝標識した。その後、培養細胞を急速凍結した。細胞を凍結後、凍結割断装置を用いてで細胞を凍結割断した。その後、一部のサンプルでは、エッチングをすることにより、割断表面の氷を昇華させ、生体膜の親水性領域を露出させた。その後、炭素と白金を蒸着することにより、レプリカ薄膜を作成した。レプリカ薄膜をPBSで洗浄後、biotin-azide溶液で処置し、クリックケミストリー反応を起こして、生体膜内のアルキン化脂肪酸をbiotionで標識した。その後、マウス抗biotin抗体、そして10 nm金コロイド標識抗マウスIgG抗体で標識を行なった。エッチングを行なったレプリカ薄膜では、アルキン化オレイン酸あるいはアルキン化アラキドン酸共に、生体膜において特異的な標識を得ることはできなかった。従って、レプリカ上での疎水性領域である脂肪酸の可視化は困難を要し、未だ開発予定の新規凍結レプリカ脂肪酸標識法の開発法の確立には至っていないのが現状である。そこで同じクリックケミストリーを用いたホスファチジルコリンのレプリカ上での可視化を試みた。アルキン化したコリンのアナログであるプロパジルコリンをあらかじめ哺乳類培養細胞に取り込ませ、急速凍結・凍結割断法により細胞膜及び各種オルガネラのレプリカ膜上でクリックケミストリー反応を試みホスファチジルコリンの標識を行った。生体膜上での標識は観察でき、レプリカ上でホスファチジルコリンの標識は可能であると判断できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定していた酵母細胞あるいは培養哺乳類細胞を用いた脂肪酸の微細局在を、未だ観察する技術が確立できずにいる。しかしながら、ホスファチジルコリンの前駆体であるプロバジルコリンを用いたホスファチジルコリンのレプリカ上での可視化は成功しており、脂肪酸の微細局在可視化の足場作りはできたと思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
各種生体膜のレプリカ膜上での脂肪酸の微細局在を可視化することが本研究の目的であるが、現在、その技術の確立に困難を要している。しかしながら、プロパジルコリンを用いることにより、クリックケイストリー法でレプリカ膜上での脂質の微細局在を可視化できることが判明した。今後も考えられ得る全ての方法を試すことにより、脂肪酸の可視化方法の確立に向け実験を行う予定である。場合によっては、生体膜を扱うのではなく、ひとまず人工のリポソームを急速凍結し、凍結割断レプリカを作成し、リポソームでの各種脂肪酸を可視化し、その微細分布を検討することを念頭において実験を行うことも視野に入れて技術の確立を行うことも考えている。この技術を確立することにより人工膜における各種脂肪酸の種類と微細分布の関係を決定できると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染症の影響により、実験の進行が遅れ計画を延長する必要があったため。次年度は、人工リポソームおよび生体膜の脂肪酸をレプリカ上で標識を試み、そのためにクリックケミストリー関連の試薬を残りの予算で購入予定である。
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