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Cas13の不活性型は、狙ったRNAに結合する事が可能であり、mRNAの編集や、可視化に利用されている。そこで、二つのCas13に分割した転写因子を融合し目的のmRNAの存在によりスイッチをオンする分子の開発を試みた。前年度に続きスイッチの改良を試みた。問題となったのは、ターゲットのRNAない状態でのバックグランドシグナルであった。前年度のリンカーの改変はバックグラントの改善には寄与しなかったことから、分解シグナルの付与、ケージドタイプのインテイン、核移行シグナルの検討について行った。その結果、いづれも大きな改善は見られず、活性全体の低下を引き起こす結果となった。特に問題となったのが、全体の活性の低下とバックグランドの低下が相関してしまい、両立の維持が困難な事であった。よってオンオフの二値的な制御は困難と考え、ターゲットRNAの存在下で、より活性を上昇させる機構として、設計することにした。まず、インテインを選択することにより、バックグランドの活性は高いが全体の活性を非常に上昇させたもの、バックグランドは低いが非常に活性の低いスイッチの作成に成功した。要素の入れ替えを行った結果、バックグランドを上昇させる要因として、細胞内の局在配列とインテインの活性そのものが寄与していることを見出した。また、gRNAの長さを増やしたり、複数のgRNAを導入することは活性の上昇には、大きく寄与せず、ターゲットRNA上の特定のgRNAのペアが活性に十分であることが示唆された。さらに、全体の活性をあげるのに二本鎖RNA結合ドメインの付加が有効であることが判明した。これらの結果をふまえて、細胞内空間的隔離を行うドメインの検討と、最適なgRNAの選択に関して、さらに改良の余地があると考えられる。今後、これらの知見を元に、改良を行い、非分裂細胞である神経細胞での検討を行いたいと考えている。
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