| 研究課題/領域番号 |
19K22459
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
和田 崇之 大阪市立大学, 大学院生活科学研究科, 教授 (70332450)
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| 研究分担者 |
西川 禎一 帝塚山学院大学, 人間科学部, 特任教授 (60183539)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| キーワード | 腸内細菌 / 宿主適応 / 定着因子 / 分子進化 |
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| 研究実績の概要 |
腸内細菌科細菌の宿主定着因子である「F4因子」およびその相同因子がヒト、動物、植物など、多様な宿主から分離されることに着眼し、各種動物群からのF4因子の配列同定、および遺伝子保有菌の分離培養を試みている。特に、捕食－被食関係のような生態相関がある宿主間には、定着因子の相同性が微生物の伝播拡散を示すエビデンスとして検出できる可能性がある。これを直接検証することを目的として、本年度は野生動物の糞・腸内容物試料が比較的入手しやすい草原環境を対象とした調査を実施した。放牧されたウシの有無によって地域を2群化し、草食性/肉食性昆虫、小型爬虫類（トカゲ）、小型哺乳類（ネズミ）の糞または腸内容物、放牧群ではウシ糞の採取を行ったが、2020年度は調査期間を十分に確保できなかったことから、2021年度に期間延長によって継続して実施する予定である。
ヒトの下痢症患者から分離され、F4因子を宿主定着因子として保有している腸管接着性大腸菌O169:H41では、本因子における主要タンパク質であるFaeGを2種類保有している（FaeG1, FaeG2）という特徴を持つ。家畜（ウシ、ブタ）における血清学的調査から、これらに対する抗血清陽性となる個体がいずれも存在することが示された。本因子はヒト培養細胞への接着能も合わせて確認されていることから、単一の接着因子として複雑な宿主（感染細胞）ネットワークを形成しうる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2020年度はコロナ禍の影響により、当初の目的であった多様な宿主を対象とした遺伝子探索研究について大きく立ち遅れた。調査日程設定の目処を立てることが難しく、野外調査に基づく研究予定については現時点で採取した試料を用いた散発的な分析に注力せざるを得ない状況となっている。また、リアルタイムPCRによるF4型接着因子の遺伝子検出についても、実験消耗品の世界的枯渇によって十分に実施できない状況が続いており、研究期間を延長した2021年度においても検出系の変更を検討して対処する。
F4因子（K88抗原）の相同性検索によって大腸菌F4型接着因子の遺伝子配列を網羅的に入手した。系統解析から、これらは既知接着因子であるCS23やCS31A、Lda (Locus for Diffuse Adherence) を含む遺伝系統クラスタ（F4RAE-G1: F4-related adhesin in E. coli Group1）を形成する一方、毒素性大腸菌O169:H41が保有するF4型接着因子はこれらと相同性が低いことが示された。本年度までに、O169:H41由来F4型接着因子の多様な宿主ネットワークが示唆されていることから、相同遺伝子群（hypothetical F4RAE-G2）を体系的に探索することで、F4型接着因子群の新たな遺伝的多様性の解明が期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き、F4因子群の配列情報を網羅的に集積する。野生動物、動物園動物を対象に糞試料を収集し、遺伝子陽性が認められた試料について保有菌株の分離を試みる。しかし、今年度もコロナ禍の影響が懸念されるため、ヒト・家畜由来糞試料を含めた現存サンプルの精査を中心とする。
対象菌種としては、腸内細菌科の中から大腸菌に注力し、F4RAEの網羅的検出を優先的に実施する。F4RAE-G2の相同遺伝子に関する配列情報が現時点で存在しないことから、PCR用プライマー・プローブを再設計し、高い遺伝的多様性に配慮した手法として確立する。
F4RAE陽性となった検体については、腸内細菌増菌および大腸菌選択培地による培養により、F4RAE保有菌株の分離を試みる。また、コロニーハイブリダイゼーション法を導入し、F4RAE遺伝子を直接検出することによってコロニー選別を行う。F4因子群はプラスミド上にコードされているため、分離株は長鎖解読（PacBio RSまたはMinION）および短鎖解読（Illumina MiSeq）を行い、全ゲノム配列およびプラスミド完全長配列を決定する。
得られた配列データは、(1) コアゲノム、(2) F4RAEシャペロン (faeE）、(3) F4RAE構造タンパク質（faeG）に分けて配列比較、系統解析を行う。ここから菌株ごとの近縁性とF4型接着因子群における分子進化の宿主適応への寄与を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は、感染症流行のために計画していた野外調査がほとんど実施できなかった。また、検査用消耗品の枯渇が世界規模で発生し、予定していた定着因子群遺伝子の検出も十分に実施できなかったことから、研究計画を１年間延長することとした。
今年度も感染症の影響によって同等の状況に陥る可能性があることから、調査研究の予定を縮小し、現存試料の解析に注力するための実験消耗品確保を優先する。また、昨年度実施できなかった菌株の分離培養、塩基配列決定のための培地類・実験キット類・試薬を購入する予定である。
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