| 研究課題/領域番号 |
19K22534
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
中村 教泰 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (10314858)
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| 研究分担者 |
中村 純奈 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10821944)
西尾 忠 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (80401892) [辞退]
KIM HYUNGJIN 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (80711457)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| キーワード | マクロファージ / 有機シリカナノ粒子 / エンドサイトーシス / タイピング / 特異性 |
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| 研究実績の概要 |
マクロファージは生体のすべての組織に存在する免疫細胞で、生体に侵入した様々な異物や病原体、体内で生じた変性物質などを認識し、エンドサイトーシスにより取込んで処理する。マクロファージは生体の恒常性維持、感染など免疫に重要であると共に病態にも関与している。現在、マクロファージは組織マクロファージや疾患関連マクロファージの多様性やタイピングの議論が活発化している。しかしながら、現在のタイピングの方法には限界があり、新たなアプローチが必要とされている。我々は独自の多機能粒子作製技術を駆使しマクロファージのエンドサイトーシスを多角的に検討することでタイピングし、マクロファージの“多様性”の解明を進めると共に“特異性”へと変革することに挑戦する。そして感染など様々な免疫機構に特異的に関与するマクロファージや疾患特異的なマクロファージの同定と制御へと発展させる。マクロファージが関連する感染症やがん、成人病に対してマクロファージ特異性の解明による革新的医療の実現が最終的な目的である。
令和1年度はマクロファージのタイピングのため、様々な大きさと蛍光を持つ多機能粒子を作製した。粒子の表面に種々の電荷を持つポリマーや低分子化合物を結合し、粒子は動的散乱法にてサイズや表面電位熱質量分析にて結合量の評価を行った。培養マクロファージを用いてエンドサイトーシス・タイピングを行った。フローサイトメトリー による粒子に結合する細胞の比率と結合量を測定、粒子の細胞への結合を形態学的・経時的に評価のためタイムラプス顕微鏡、さらには共焦点顕微鏡により3次元所見による粒子の細胞内分布の解析を進めることができた。走査型電子顕微鏡観察により細胞の粒子結合と取込みの様式の微細形態の評価と共に光-電子相関顕微鏡法、そして集束イオンビーム走査電子顕微鏡による内部観察へ向けた共同研究を進行できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
マクロファージのタイピングのため、様々な大きさと蛍光を持つ多機能粒子を作製した。粒子の表面に種々の電荷を持つポリマーや低分子化合物を結合し、粒子は動的散乱法にてサイズや表面電位熱質量分析にて結合量の評価を行った。ポリマーにおいてはその長さにより粒子上での存在様式が異なり、その差異によるエンドサイトーシスの変化が注目された。培養マクロファージを用いてエンドサイトーシス・タイピングを行った。フローサイトメトリー による粒子に結合する細胞の比率と結合量を測定、粒子の細胞への結合を形態学的・経時的に評価のためタイムラプス顕微鏡、さらには共焦点顕微鏡により3次元所見による粒子の細胞内分布の解析を進めることができた。マクロファージは粒子表面の構造の変化によりエンドサイトーシスに変化があり、その機序の詳細な検討のための事例を多数得ることができた。さらに、エンドサイトーシスの詳細な形態学的評価のため、光-電子相関顕微鏡法について検討を進め、有用な所見が得られつつある。さらに集束イオンビーム走査電子顕微鏡による内部観察のための共同研究を開始することができ、精密なエンドサイトーシス評価のための体制の構築が進展した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は本年度の成果と共にさらに多種の粒子によりエンドサイトーシスの多様性、そして特異性について慎重に検討をすすめたい。令和1年度に引き続き、粒子の種類を増やしつつ、培養マクロファージを用いてエンドサイトーシス・タイピングを行う。さらにマウスへの経静脈投与による生体内でのエンドサイトーシス・タイピングを遂行する。臓器の組織切片を作製し、蛍光顕微鏡観察で各種粒子の分布評価を行う。さらにScaleCubic法等にて透明化処理し、マクロならびにミクロ観察用の共焦点顕微鏡で粒子の分布の三次元的観察を行う。さらに培養細胞に加え、臓器レベルにおける精密観察を行う。光-電子相関顕微鏡法による観察を効率化と共に深化させ、集束イオンビーム走査電子顕微鏡による各粒子の細胞内局在の超高解像度の鑑別観察へ進め、エンドサイトーシスによるマクロファージ特異性の解明を展開させたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初購入予定であった細胞培養用CO2インキュベーターが、他の経費で事前に購入することになった。本研究費では小型の安価な細胞培養用CO2インキュベーターを購入することにより遂行が可能となり、その差額により主な次年度使用額が生じた。また本年度は粒子の表面に結合させるポリマーなどの試薬においては安価なものから購入し、それらにより有意な成果が得られ集中的に研究を行い、他の高価な試薬の購入経費が減少した点などにより次年度使用額が生じた。
次年度は高価な試薬の多数購入を予定すると共に蛍光ナノ粒子の再調製や大量作製による大量の試薬の使用を計画している。また細胞内での粒子の局在観察の効率化のための器具等も検討する予定である。
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