| 研究課題/領域番号 |
19K22540
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
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| 研究分担者 |
星野 温 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50737210)
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| キーワード | CAR T / 中和抗体 / ライソゾーム病 / Electroporation / mRNA |
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| 研究実績の概要 |
当初の予定通り、細胞を用いてGLA酵素（alpha-galactosidase）とキメラレセプター（TM, CD28, 4-1BB, CD3zeta）結合させたBARキメラタンパク質を発現させたBAR細胞の作製を試みた。
このBARタンパク質配列を設計し、mRNAを合成した。このmRNAを細胞に導入し、細胞内での発現をウェスタンブロッティング法にて確認した。しかしながら、タンパク質発現は短期的には確認できたものの、長期間の発現維持が困難であった。mRNAの不安定性からこの結果になったと考え、BARキメラタンパク質を発現させるレトロウイルスベクターを再設計した。またGLAのシグナル配列（1-31aa）はBAR遺伝子に適していない可能性が高い。これはGLAがライソゾーム酵素のため、合成されたBARタンパク質が細胞内のライソゾームに局在している可能性があるためである。そこで新たにレトロウイルスベクターにGLA酵素の元来のシグナル配列（1-31）をCAR-Tで利用されているCD8由来のシグナル配列に置き換えることにした。
これとは別にBAR細胞のターゲットとなるGLA抗体を産生する細胞の樹立も試みた。このB細胞を模すため、レトロウイルスベクターにてscFV_GLAを恒常的に発現させる細胞を作製した。さらに細胞外にBARタンパク質の発現を確認するためにGLA抗体のscFVと蛍光タンパク質（mCherry）を融合させた遺伝子も設計した。このscFV_GLA-mCherryは細胞外に分泌されることはHEK293細胞を用いて確認できた。
以上のように本年はマテリアル作製を進めており、これらを用いて本系のvitroにおけるPOC確立を優先させ、その後、RNAを用いた系の構築を検討することにした。最終的にはこの系をvivoに適応させ、BARシステムの構築を完成させる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初のRNAでの適応はRNA分解が予想より早いため、細胞での実験が困難であった。そこでまずはレトロウイルスを用いてのPOCの確立を優先する。それとは別に合成RNAの安定化に必要な因子についても探索し、今後の実験に役立てていく。
現在は抗体発現細胞とBAR発現細胞の作製に必要なベクターは構築できたので、今後はBAR発現細胞を樹立する。
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| 今後の研究の推進方策 |
Vitroの研究成果をもとにVivoへの適応を進めていきたい。そのためにモデルとなる細胞は樹立を進めており、ターゲットとなる抗体発現細胞と、アタッカーとなる抗原発現細胞（BAR細胞）をそれぞれ樹立している。
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