研究課題
我々の予備研究結果から、メスのES細胞はオスに比べてDNA２本鎖切断を相同組換え修復できにくいことが示唆された。ES細胞やiPS細胞だけでなく、ヒト乳がん細胞でもある程度の頻度で両X染色体が活性化状態(XaXa)にある。XaXaであるがん細胞はHRR能が抑制されている可能性が高く、DNAの切断や変異が修復され難く、悪性度の上昇を来す可能性が高い。本研究ではこの現象をさらに検証した。同一バックグラウンドのオス(XX)、メス(XY)のES細胞を１ペアの母親から複数クローン樹立することに成功した。十分未分化であり、XOの存在率は低いクローンであることが判明した。Clonogenic assayによりDNA傷害に対する相同組換え修復能を比較したところ、メスのES細胞は、メスのES細胞はオスES細胞に比べて有意にカンプトテシンに対して死に易いことがわかり、相同組換え修復能が低くDNA損傷を修復できにくいことが示唆された。また、Nanog-GFPを用いた解析で、メスのES細胞はオスES細胞に比べて相同組換え能が低いことが示唆された。さらにそれを検証するため、Dox-inducible-Xistを導入したES細胞クローンを樹立して、Dox(+)でX染色体を不活化した時の影響をclonogenic assayおよびHR assayで検証したところ、Dox(+)で誘導されたXaXiにおいて相同組換え能が回復することが示唆された。一方で、同一バックグラウンドのオス(XX)、メス(XY)のES細胞を用いて、発現遺伝子の解析をRNA-Seqにより行い、メスで相同組換え能が低い原因となる遺伝子を現在解析している。
3: やや遅れている
研究実績の概要に示したように、RNA-Seqによりメスで相同組換え能が低い原因となる遺伝子を現在解析している。候補遺伝子が複数ありその解析に時間がかかっている。さらに、これまでの研究結果の再現性の確認を行っており、研究完了が遅れて研究期間の延長を申請した。
RNA-Seqによりメスで相同組換え能が低い原因となる遺伝子の候補について、それらをノックダウンし、clonogenic assayおよびHR assayを用いてメスで低下した相同組換え能を回復できるか検証する。また、これまでの研究結果の再現性の確認を行い、基礎研究成果としての論文発表を目指す。
これまでの研究結果の再現性の確認を行っており、研究完了が多少遅れている。また、RNA-Seqによりメスで相同組換え能が低い原因となる遺伝子を現在解析しているが、候補遺伝子が複数ありその解析に時間がかかっている。これらの理由で次年度使用額が生じ、研究期間の延長を申請した。令和３年度は、これらの研究を遂行するために、消耗品費922,961、研究補助員雇用経費1,100,000円、論文校正および投稿料300,000円を使用する。
