| 研究課題/領域番号 |
19K22602
|
|---|
| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
|---|
研究代表者 |
田中 守 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (20207145)
|
|---|
| 研究分担者 |
落合 大吾 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (80348713)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2022-03-31
|
| キーワード | ヒト羊水幹細胞 / 間葉系幹細胞 / マクロファージ / 早産 / 胎児炎症反応症候群 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究の目的は，ヒト羊水幹細胞（Human amniotic fluid stem cells; hAFSC）の抗炎症作用を利用し，子宮頸管からの上行性感染により生じる早産/胎児炎症反応症候群（Fetal inflammatory response syndrome; FIRS）の予防効果や治療効果を動物モデルで検討することである．昨年度、LPS経腟投与モデルの確立および投与に関する予備実験を終了していた．本年度は、その動物モデルを用いてhAFSCの投与経路を腹腔内投与とし治療効果を検討した．
その結果，hAFSCの投与で早産が有意に抑制されることを見出し，胎盤，子宮頸部，腹腔内洗浄細胞などの各組織における炎症性サイトカインの発現も有意に低下していることを確認した．また，PBSに懸濁したhAFSCを腹腔内に投与すると，数時間で凝集し，投与24時間後には肉眼的に観察可能な大きさの細胞凝集体となることを，生体透過性蛍光色素を用いた実験で確認した．摘出した凝集体の組成を免疫組織染色およびフローサイトメトリー法で調べたところ，hAFSC以外に，モデル動物由来の腹腔内マクロファージが含まれることを見出した．この凝集体が治療の主役を担っているのではないかと考え，さらに詳細な解析を行うとともに，凝集体による治療効果をin vitroで再現する実験を計画している．
すでに，hAFSCを凝集体で培養するとマクロファージを炎症型（M1）から抗炎症型（M2）に極性変化させる働きを持つ抗炎症性サイトカインのTSG-6の分泌が有意に増加することを見出している．以上のことから，腹腔内に投与したhAFSCがモデル動物由来の炎症方マクロファージと凝集体を形成し，抗炎症型マクロファージへの極性変化を促進することで，全身の炎症を抑制し，結果的に早産予防につながった可能性が示唆されている．
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記のように，本年度は、hAFSCの早産予防に関する治療効果を見出し進捗があった．今後はin vitroで再現したhAFSCとマクロファージの凝集体に対して解析を行う方針である．しかし，強い接着能を持つマクロファージを，接着させずに凝集体培養することは難易度が高く，実験手技の改善が必要である．
一方、切迫早産患者の羊水からのhAFSCの分離培養は遅延している．本年度は，切迫早産患者の余剰羊水が生じた場合，病棟から分離培養に至るまでのフローの見直しを行い，よりシームレスな環境を構築し，本課題の解決に努めた．しかし，本研究に対しインフォームドコンセントを得ることができる患者が少ない上，新型コロナウイルス感染症の流行に伴う影響で院内の分娩環境にも大幅な変化があったことも要因となり，遅延は解消されていない状況にある．引き続き，ハイリスク患者の抽出および検体確保に向け努めたい．
|
| 今後の研究の推進方策 |
治療の主役を担っていると考えられる腹腔内凝集体に対する解析を中心に行う方針である．まず，腹腔内凝集体を破砕・コラゲナーゼ処理をして細胞を分散させ，フローサイトメトリー法で凝集体の組成をより詳細に明らかにする．また，凝集体内のマクロファージだけでなく，凝集体を形成していない腹腔内洗浄細胞におけるマクロファージの解析を行いたい．炎症によって腹腔内に炎症型マクロファージが動員されていると考えられるが，hAFSCの腹腔内投与によって，どの程度の細胞が抗炎症型マクロファージに変化するか，フローサイトメトリー法で定量することを計画している．
さらに，動物にチオグリコレートなどの炎症を誘発させる物質を腹腔内投与し，腹腔内にマクロファージを動員させ，これを回収してin vitroでの実験に使用したいと考えている．炎症によって誘発された腹腔内マクロファージとhAFSCを凝集体にして共培養し，どのような変化がマクロファージに生じるのかを評価したい．凝集体の免疫組織染色やRT-qPCR，フローサイトメトリー法だけでなく，可能であればRT産物を次世代シーケンサーで解析し，配列情報の違いからXenome softwareを用いて種間比較を行いたい．
最後に，切迫早産患者の羊水からのhAFSC樹立であるが，診察室でインフォームドコンセントが得られた患者から検体を採取し，速やかに実験室に搬入できるシステムを構築することを予定している．さらに，樹立した細胞を通常の羊水検査で得られた患者の細胞とシングルセルRNAシーケンシングなどを用いて比較することで，より効率の良い分離培養技術の開発を目指す．
|
