パーキンソン病マウスモデルにおける免疫チェックポイント分子PD-1の解析

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K22603
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 服部 信孝 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80218510)
• 研究分担者: 佐藤 栄人 順天堂大学, 医学部, 准教授 (00445537) ; 波田野 琢 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60338390) ; 森 聡生 順天堂大学, 医学部, 助教 (60782878)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2022-03-31
• キーワード: パーキンソン病 / Programmed cell death-1 / 制御性T細胞 / α-シヌクレイン / 腸脳連関

研究実績の概要

パーキンソン病（PD）の原因タンパクとして考えられているα-シヌクレイン(AS)が、腸から迷走神経を介して脳へ伝播する事が報告され、腸内細菌叢の変化や全身炎症がAS凝集を引き起こし病態へ関与している可能性が提唱されている。また免疫チェックポイント関連分子であるProgrammed cell death-1（PD-1）をブロックすると、制御性T細胞に作用し腸内の炎症を惹起することが知られている。そこで、PD-1の機能障害により、脳のみならず腸を通じて炎症が全身に広がり、AS凝集を惹起しPD発症に関連すると仮説を立て実験を遂行した。まずProgrammed cell death-1（PD-1）ノックアウト（KO）マウスとヒトASトランスジェニック（BAC Tg-SNCA）マウスを交配しPD-1KO/BAC Tg-SNCAを作成した。野生型（WT）、PD-1KO、BAC Tg-SNCA、PD-1KO/ BAC Tg-SNCA の4群で検討を開始し、40週齢程度までの加齢マウスについて行動解析、脳内におけるASの蓄積、チロシンハイドロキシラーゼ陽性（TH）神経細胞の脱落など検討したが、4群いずれも群間における有意差は認めなかった。今後、より加齢させた高齢マウスで検討を行うことを予定している。さらにPDにおいて関連がある炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、TNF-αについて検討を行ったところ、IL-1βがWTと比較し、PD-1KOでは約1.3倍、PD-1KO/ BAC Tg-SNCAでは約2倍程度に増加する傾向があった。PD-1をブロックすることに加え、ASが存在することで、脳内における炎症が惹起される可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通り、まずPD-1KOマウスとBAC Tg-SNCAマウスから交配しPD-1KO/BAC Tg-SNCAを作成し、加齢による運動症状の出現、脳内でのα-シヌクレインの蓄積やチロシンハイドロキシラーゼ陽性細胞の脱落、また炎症サイトカインの変化を解析した。まず8週齢から40週齢まで経時的に体重の増減と、ロータロッドによる運動機能の評価では、野生型（WT）、PD-1KO、BAC Tg-SNCA、PD-1KO/ BAC Tg-SNCAの4群でいずれも群間における有意差は認めなかった。次に、各群のマウス脳切片を抗AS抗体、抗リン酸化AS抗体での解析ではいずれの群においても明らかなAS凝集体やリン酸化ASは認めなかった。またTH抗体での解析では中脳黒質部の細胞脱落の程度を観察したがいずれの群においても明らかな脱落は認めなかった。さらに、各群のマウス中脳についてELISA法によりIL-1β、IL-6、TNF-αの測定を行ったところ、IL-1βがWTと比較し、PD-1KOでは約1.3倍、PD-1KO/ BAC Tg-SNCAでは約2倍程度に増加する傾向があった。また、孤発型PDにおいて最も頻度の高いリスク遺伝子として知られるグルコセレブロシダーゼ（GBA）遺伝子変異（L444Pヘテロ接合体）マウスとPD-1KOマウスの交配を開始する。GBA遺伝子変異型マウスも脳内のみならず全身臓器における炎症性変化が報告されており、PD-1KOマウスとの交配により、より強い全身炎症が惹起される可能性がある。

今後の研究の推進方策

PD-1KO、PD-1KO/BAC Tg-SNCAマウスは40週齢における運動症状や、脳内でのAS凝集、TH陽性神経脱落が観察されなかったことより、さらなる加齢変化の観察が必要と考えられる。そのため、70週程度まで長期の加齢変化を観察し検討を行う。また、上記マウスではPD関連炎症サイトカインの上昇傾向を認めていることから、脳内の炎症性変化が想定され、今後n=4まで個体数を増やし炎症性サイトカインのみならず、活性型ミクログリアの増生や、末梢組織から脳内への単球、Tリンパ球の浸潤など免疫学的評価を追加し、脳内炎症の程度をより詳細に解析する。また現在進んでいるGBA遺伝子変異マウスとPD-1KOマウスとの交配によって得られる個体を追加し、その運動症状や脳内での免疫組織学的なAS凝集や、微量なASシードを検出できるReal-time quaking-induced conversion法を用いた解析、炎症性変化も検討する。腸管や全身の炎症を評価するために腸内細菌叢の解析や、末梢血における炎症性サイトカインの解析を行うことで、全身の免疫変化がPD病態と関連することを実証する。

次年度使用額が生じた理由

初年度の予算使用開始時期が、2019年9月中旬からであり、当初の計画より初年度に行う実験の時期がずれ込んでしまったため次年度使用額が発生した。しかしながら、PD-1KOマウス、PD-1KO/BAC Tg-SNCAマウスの免疫組織学的・生化学的解析まで行い、一定の知見は得られており、実験の大幅な遅れには至っていない。今後の使用計画としては、計画通り、GBA遺伝子変異マウスの作成と交配を行い、順次PD-1KOマウス、BAC Tg-SNCAマウスと合わせて解析を進め、遅れを取り戻すよう最大限推し進める。

研究成果

• [雑誌論文] Loss of Parkin contributes to mitochondrial turnover and dopaminergic neuronal loss in aged mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Noda S, Sato S, Fukuda T, Tada N, Uchiyama Y, Tanaka K, Hattori N.
  • 雑誌名: Neurobiol Dis. 巻: 136 ページ: 104717
  • DOI: 10.1016/j.nbd.2019.104717.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Variants in saposin D domain of prosaposin gene linked to Parkinson's disease (2020)
  • 著者名/発表者名: Oji Y, Hatano T, Ueno SI, Funayama M, Ishikawa KI, Okuzumi A, Noda S, Sato S, Satake W, Toda T, Li Y, Hino-Takai T, Kakuta S, Tsunemi T, Yoshino H, Nishioka K, Hattori T, Mizutani Y, Mutoh T, Yokochi F, Ichinose Y, Koh K, Farrer MJ, Uchiyama Y, Akamatsu W, Wu YR, Matsuda J, Hattori N, et al.
  • 雑誌名: Brain. 巻: 143 ページ: 1190-1205
  • DOI: 10.1093/brain/awaa064.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Noda S, Sato S, Fukuda T, Tada N, Hattori N.
  • 雑誌名: Mol Brain. 巻: 13 ページ: 46
  • DOI: 10.1186/s13041-020-00585-6.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A metabolic profile of polyamines in parkinson disease: A promising biomarker. (2019)
  • 著者名/発表者名: Saiki S, Sasazawa Y, Fujimaki M, Kamagata K, Kaga N, Taka H, Li Y, Souma S, Hatano T, Imamichi Y, Furuya N, Mori A, Oji Y, Ueno SI, Nojiri S, Miura Y, Ueno T, Funayama M, Aoki S, Hattori N.
  • 雑誌名: Ann Neurol. 巻: 86 ページ: 251-263
  • DOI: 10.1002/ana.25516.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Metabolomics-based identification of metabolic alterations in PARK2. (2019)
  • 著者名/発表者名: Okuzumi A, Hatano T, Ueno SI, Ogawa T, Saiki S, Mori A, Koinuma T, Oji Y, Ishikawa KI, Fujimaki M, Sato S, Ramamoorthy S, Mohney RP, Hattori N.
  • 雑誌名: Ann Clin Transl Neurol. 巻: 6 ページ: 525-536
  • DOI: 10.1002/acn3.724.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Plasma metabolite biomarkers for multiple system atrophy and progressive supranuclear palsy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mori A, Ishikawa KI, Saiki S, Hatano T, Oji Y, Okuzumi A, Fujimaki M, Koinuma T, Ueno SI, Imamichi Y, Hattori N.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 14 ページ: e0223113.
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0223113.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Parkinson's disease-associated iPLA2-VIA/PLA2G6 regulates neuronal functions and α-synuclein stability through membrane remodeling. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mori A, Hatano T, Inoshita T, Shiba-Fukushima K, Koinuma T, Meng H, Kubo SI, Spratt S, Cui C, Yamashita C, Miki Y, Yamamoto K, Hirabayashi T, Murakami M, Takahashi Y, Shindou H, Nonaka T, Hasegawa M, Okuzumi A, Imai Y, Hattori N.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A. 巻: 116 ページ: 20689-20699
  • DOI: 10.1073/pnas.1902958116.
  • 査読あり
• [学会発表] パーキンソン病・PARK2患者におけるバイオマーカーとしての酸化型アルブミン. (2019)
  • 著者名/発表者名: 上野真一, 波田野琢, 奥住文美, 斉木臣二, 王子悠, 森聡生, 濃沼崇博, 藤巻基紀, 安川惠子, 矢冨裕, 池田均, 服部信孝.
  • 学会等名: 第13回パーキンソン病・運動障害学会コングレス
• [学会発表] Serum non-mercaptalbumin as a potential biomarker in Parkinson’s disease and related disorders (2019)
  • 著者名/発表者名: Ueno SI, Hatano T, Okuzumi A, Saiki S, Oji Y, Mori A, Koinuma T, Fujimaki M, Takeshige-Amano H, Yasukawa K, Yatomi Y, Ikeda H, Hattori N.
  • 学会等名: 23rd International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders. Sep 22-26, Nice, France.
  • 国際学会
• [学会発表] Synaptic dysfunction in a Drosophila model of PARK14 (2019)
  • 著者名/発表者名: Hatano T, Mori A, Inoshita T, Fukushima-Shiba K, Koinuma T, Yamashita C, Imai Y, Hattori N.
  • 学会等名: 23rd International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders. Sep 22-26, Nice, France.
  • 国際学会
• [学会発表] The evaluation of exosomes as a biomarker of Parkinson’s disease (2019)
  • 著者名/発表者名: Ishiguro Y, Tsunemi T, Yoroizaka A, Hattori N.
  • 学会等名: 23rd International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders. Sep 22-26, Nice, France.
• [図書] 大脳基底核の変性疾患、神経疾患、6 神経変性疾患、内科学書 Vol. 6 改訂第9版、神経疾患 (2019)
  • 著者名/発表者名: 服部信孝
  • 総ページ数: 659
  • 出版者: 株式会社 中山書店
  • ISBN: 978-4-521-74749-1
• [学会・シンポジウム開催] The 19th “Takamatsu” International Symposium for PD & MD ((IPDST) (2020)