Jagged1遺伝子発現を制御する筋ジストロフィー治療薬の探索

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K22604
• 研究機関: 東京医科大学
• 研究代表者: 川原 玄理 東京医科大学, 医学部, 准教授 (40743331)
• 研究分担者: 林 由起子 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (50238135)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2021-03-31
• キーワード: 筋ジストロフィー / Jagged1 / ゼブラフィッシュ / ドラッグスクリーニング

研究実績の概要

令和元年度は、ゼブラフィッシュjagged１の発現をコントロールする薬剤を同定するために必要となる、薬剤スクリーニングに用いるトランスジェニックフィッシュの作製を目的とし、（１）ゼブラフィッシュjagged１プロモーター領域のゲノムDNAのクローニング、（２）マイクロインジェクションによるjagged１トランスジェニックフィッシュの作製、を行った。ゼブラフィッシュのjagged１翻訳開始コドンの上流領域の塩基配列をEGFPのベクターの配列に組み込み、その発現を解析することで、jagged１翻訳開始コドンの上流約500塩基対がjagged１の発現制御に重要であることを明らかにした。このjagged１プロモーター領域の配列をEGFPをコードする塩基配列の上流領域に組み込んだベクターを受精卵に注射することにより、ゼブラフィッシュのゲノムDNAにこれらが組み込まれたトランスジェニックゼブラフィッシュを作成することに成功した。これらの個体を第一世代（F0）として、成魚まで成長させ、野生型と交配し次世代（F1）を作製した。F1個体群の中から、EGFP陽性を示す個体をスクリーニングし、主に脳、脊髄においてEGFPシグナルが強く観察される個体が得られた。つまりこれらの個体は、EGFPシグナルにより間接的にjagged１の発現が観察可能である。さらにこれらの個体をさらに野生型の個体と交配してF2世代を作製した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ゼブラフィッシュjagged１ 翻訳開始コドンの上流領域、約500塩基対がjagged１プロモーター領域として、その発現制御に重要であることが明らかになり、このjagged１プロモーター領域をEGFPをコードする遺伝子配列の上流に組み込んだベクターを導入した個体を得ることができた。これらの変異体を第一世代（F0）として、 次世代を作製し、脳、脊髄でEGFPの発現が強く観察されるトランスジェニックフィッシュが得られており（F1）、現在のところ計画通り達成されている。得られたjagged１トランスジェニックフィッシュの解析、そして薬剤スクリーニングを行うため、個体群を増やし、現在、得られたjagged１トランスジェニックゼブラフィッシュを用いた薬剤スクリーニングに取り掛かっている。

今後の研究の推進方策

次年度は、令和元年度に作製したjagged１トランスジェニックフィッシュを用いて、jagged１の発現制御物質のスクリーニングを行う。1,280個の薬剤が含まれるライブラリーのスクリーニングを完了し、jagged１の発現に影響を与える薬剤を特定する。そのスクリーニングにより、jagged１の発現制御する候補薬剤とその分子機序を明らかにしjagged１遺伝子の発現に関連した筋ジストロフィーの治療法開発に役立つ分子の新規発見をめざす。

次年度使用額が生じた理由

令和元年度は、国際学会への参加が無かったことと、いくつかの抗体購入を行なったことが、次年度使用額を生じた理由である。使用計画としては、国外で行われる国際学会への参加（参加登録費、旅費等）、プロジェクトに使用する抗体の購入、作製を予定している。

研究成果

• [雑誌論文] Antagonists for serotonin receptors ameliorate rhabdomyolysis induced by 25D-NBOMe, a psychoactive designer drug. (2020)
  • 著者名/発表者名: Genri Kawahara, Mami S. Nakayashiki, Hideyuki Maeda, Ruri Kikura-Hanajiri, Ken-ichi Yoshida, and Yukiko K. Hayashi.
  • 雑誌名: Forensic Toxicology 巻: 38 ページ: 122-128
  • DOI: 10.1007/s11419-019-00495-w.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Promoting plasma membrane repair via AMPK comple activation improves muscle phenotypes of dysferlinopathy. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hiroya Ono, Naoki Suzuki, Shin-ichiro Kanno, Genri Kawahara, Rumiko Izumi, Toshiaki Takahashi, Yasuo Kitajima, Shion Osana, Tetsuya Akiyama, Kensuke Ikeda, Tomomi Shijo, Shio Mitsuzawa, Hitoshi Warita, Ryoichi Nagatomi, Nobukazu Araki, Akira Yasui, Yukiko K. Hayashi, Katsuya Miyake, Masashi Aoki
  • 雑誌名: Molecular Therapy 巻: 28 ページ: 1133-1153
  • DOI: 10.1016/j.ymthe.2020.02.006.
• [雑誌論文] Discovery of novel therapeutics for muscular dystrophies using zebrafish phenotype screens. (2019)
  • 著者名/発表者名: Jeffrey J. Widrick, Genri Kawahara, Matthew S. Alexander, Alan Beggs, Louis M. Kunkel.
  • 雑誌名: J. Neuromuscular Diseases. 巻: 6 ページ: 271-287
  • DOI: 10.3233/JND-190389.
  • オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 筋疾患ゼブラフィッシュモデルを用いた薬剤スクリーニング (2020)
  • 著者名/発表者名: 川原 玄理 林 由起子
  • 学会等名: 第97回 日本生理学会
• [学会発表] murf1トランスジェニックゼブラフィッシュを用いたドラッグスクリーニング (2019)
  • 著者名/発表者名: 川原玄理、中屋敷真未、林由起子
  • 学会等名: 第五回日本筋学会
• [学会発表] ゼブラフィッシュを用いた筋萎縮治療薬剤スクリーニング (2019)
  • 著者名/発表者名: 川原玄理、中屋敷真未、林由起子
  • 学会等名: 第8回医薬工３大学包括連携推進シンポジウム