研究課題
２年計画の２年目に相当する２０２０年度は、近接性ラベリングの本実験を行った。遺伝性先天性甲状腺機能低下症の責任遺伝子の１種である転写因子PAX8分子のC末端TurboID融合タンパク質を安定発現させたHeLa細胞株を作製し、近接性ラベリングを実施した。この際、野生型PAX8分子のみならず、DNA結合ドメインの変異であるQ40Pと転写活性化ドメインの欠失体であるR364*も作製した。また、コントロールとしてTurboIDに核移行シグナル（NLS）を連結したコンストラクトを作製し、PAX8-TurboIDと並行して解析した。キャプチャされたビオチン化タンパク質のLC-MS/MS解析ではそれぞれ約4,000種のタンパク質がヒットし、duplicate間での相関係数は0.95以上と安定的な解析であることが確認できた。野生型PAX8サンプルにおいて有意な近接性を認めた分子としてEP300、NCOA1などPAX8との相互作用が想定された既知分子が捉えられており、近接性ラベリングとしての有効性が確認された。この他、NCOR1/2リプレッサー複合体の構成要因、SWI/SNF複合体の構成要因などが同定され、PAX8が組織特異的転写因子として複数の経路で標的遺伝子の転写活性化を起こすことを初めて示すことができた。また、変異体のうちR364*ではこれらの複合体との近接性が低下しており、R364*により欠失するC末端配列がこれら複合体とのタンパク質相互作用を担う可能性が示唆された。一方、対照的に、Q40P変異を有するPAX8の近接性タンパク質のシグネチャは野生型とほぼ同等であり、標的DNAとの結合が完全に喪失する状況下においてもコアクティベーター分子群がリクルート可能であることが示された。
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