| 研究課題/領域番号 |
19K22672
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
岩崎 倫政 北海道大学, 医学研究院, 教授 (30322803)
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| 研究分担者 |
照川 アラー 北海道大学, 医学研究院, 助教 (00723074)
古川 潤一 北海道大学, 医学研究院, 特任准教授 (30374193)
宝満 健太郎 北海道大学, 医学研究院, 博士研究員 (40823331)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2023-03-31
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| キーワード | マウス軟骨細胞 / 免疫応答 / スフィンゴ糖脂質 |
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| 研究実績の概要 |
間葉系幹細胞や軟骨細胞などの細胞をin vitroで継代すると、細胞の生理的・免疫的な挙動が変化することを明らかにし、継代培養された細胞はマクロファージを含む免疫細胞と交互作用することを突き止めた。これらの作用が生じるための最小限の細胞継代数を決定することは、この免疫的な挙動を担う細胞表面の糖鎖構造解析のターゲットを絞る上で不可欠である。8週齢のC57／B6マウスの腹腔内マクロファージを単離し、軟骨細胞または間葉系幹細胞を含む継代細胞とマクロファージとを共培養することで直接相互作用実験を行った。間接的相互作用実験では、軟骨細胞および間葉系幹細胞をトランスウェルインサートに播種してマクロファージと共培養した。これらの上清を酵素免疫吸着法（ELISA法）を用いて炎症性サイトカインの濃度を測定した。マクロファージと継代細胞の直接共培養では、継代3（P3）の軟骨細胞との培養では、P0の軟骨細胞に比べてIL-6のレベルが増加した。一方、P6軟骨細胞を用いた培養では、P2軟骨細胞を用いた培養と比較して、IL-6のレベルが増加した。間接培養では、IL-6の増加は培養群間で有意差はなかった。これらの結果は、マクロファージの活性化には、継代細胞との直接的な相互作用が必要であることを示唆している。次に、直接共培養モデルにおいて、一酸化窒素（NO）およびTNF-αなどの炎症マーカーのレベルを測定した。P3軟骨細胞やP6間葉系幹細胞と共培養したマクロファージでは、NOやTNF-αのレベルが顕著に上昇した。これらの結果から、軟骨細胞は継代2まで、間葉系幹細胞は継代5まで使用可能であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
細胞の継代数を増やすと、マクロファージが活性化し、炎症性サイトカインの産生が促進されることが実証され、その反応を起こす継代数にはプラトーが存在した。これらの結果は、マクロファージが継代による移植細胞表面の変化を認識し、免疫反応の活性化や継代細胞のクリアランスにつながっている可能性を示唆している。限定された継代数に対して、包括的糖鎖スクリーニングを実施したところ、標的とするサブグライコームがスフィンゴ糖脂質に絞られた。この標的糖鎖分子に関して、単球のIL-6およびIL-10産生を増加させる報告はあるが、マクロファージにおける知見はこれまで出ていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
2022年度は、スフィンゴ糖脂質に属する標的糖鎖分子を形成するために必要な糖転移酵素遺伝子の発現抑制マウスを作出し、そのマウスから単離し継代培養された細胞とマクロファージを含む免疫細胞との交互作用を解析する。我々は以前に、対象とする糖転移酵素遺伝子のノックアウトマウスを扱った実験の実績があり、精子保存されているその種を起こして本研究の実験系へ供する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍における研究活動の制限、必要試薬の輸送遅滞により次年度へ持ち越される実験が発生した。次年度には、糖転移酵素遺伝子のノックアウトマウスを用いて標的糖脂質の生合成関連酵素を欠損させる実験を遂行する計画である。
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