| 研究実績の概要 |
本研究では、生体試料における目的タンパクの定量法を開発し、次いで、実検体で切断されているペプチドフラグメントを同定し、法医診断に資するタンパク(ペプチド)マーカーの探索を行うことを目的とする。対象となるタンパクとしては、熱中症で上昇するmyoglobin、心不全で上昇するNT-proBNPが挙げられる。
本年度は、昨年度に引き続き、標準尿サンプル、特に腐敗尿からのmyoglobinの検出条件について検討した。本年度は、解析手法をプロテオーム解析に変更した。
市販の尿試料を37℃のドライオーブンで2週間放置し腐敗させたものと、同一尿を凍結保存したものを使用し、標準品ヒトリコンビナントmyoglobinを新鮮尿および腐敗尿試料に、それぞれ 0、20、50 ng/mLになるよう添加し、以下の実験に供した。各尿試料 250 microLにアセトニトリル1000 microL を加えて voltex後に氷上で10分インキュベートし、その後2000×gで遠心分離し、上清を除去して沈殿を回収した。この沈殿にEasyPep mini MS Sample Prep kit中のLysis bufferを110 micorL添加し溶解し,その内 100 microLをtrypsin 及びLysil-endopeptidase でdigest し、精製後試料についてプロテオーム解析を行った。myoglobinは、新鮮尿、腐敗尿のいずれについても添加していないものでは検出されず、20 及び 50 ng/mL添加したものは、すべてのサンプルで検出された。ただし、シグナル強度は、 20 ng/mLで約 3分の1、 50 ng/mLで約 40分の1に減少した。このことは、腐敗サンプルでmyoglobin が検出されない理由として、夾雑物によるマスク効果が一定の役割を果たしていると推定された。
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