| 研究課題/領域番号 |
19K22780
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| 研究機関 | 日本獣医生命科学大学 |
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研究代表者 |
高野 貴士 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (20462781)
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| 研究分担者 |
安井 文彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, プロジェクトリーダー (40399473)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2022-03-31
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| キーワード | 単純ヘルペスウイルス1型 / 潜伏感染 / 再活性化 / 宿主因子 |
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| 研究実績の概要 |
単純ヘルペスウイルス（HSV）は、高頻度に回帰発症を起こす事が知られているが、その機序は不明である。本研究では、HSVが有する潜伏感染持続因子のLATを外因的に発現させ、潜伏感染を持続させる事により回帰発症を予防するのが目的である。令和元年度は、①LAT発現抑制能を有する宿主因子とHSVゲノムの結合部位の同定、②宿主因子との結合配列を除去したLAT発現プラスミドの構築と宿主因子存在下でのLAT発現量の検討、③宿主因子と結合しないLAT（decoy LAT）を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）構築に必要なプラスミドの準備を行った。
宿主因子とHSVゲノムの結合部位の同定では、始めに、HSVのゲノム解析から宿主因子との結合が予想される部位を推定した。その後、ルシフェラーゼ遺伝子を付加したHSVゲノムのdeletion mutantを作製し、レポーターアッセイを行った。レポーターアッセイでは、宿主因子存在下でも測定値に変化を及ぼさないdeletion mutantを見いだし、HSVゲノムと宿主因子が結合する領域を決定した。この結果を基に、宿主因子との結合配列を除去したLAT発現プラスミドを構築して、宿主因子存在下でのLAT発現量およびLATから派生するmicroRNA発現量をリアルタイムPCRで確認し、両者の発現抑制が阻害されている事を確認した。decoy LAT発現組換えAAVについては、組換えAAVを構築するのに必要なプラスミドを入手した。現在、decoy LATの発現ユニットを組み込んだプラスミドを構築しており、組換えAAV作製に向け準備を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上述の通り、令和元年度遂行予定の項目について概ね実施を完了しており、研究計画の変更等の問題が生じていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の研究計画に従って遂行する予定である。
decoy LAT発現組換えAAVを構築するために必要なプラスミドを構築後、HEK293細胞に導入して組換えAAVを得る。その後、組換えAAVをマウスに接種して三叉神経節へのdecoy LAT導入効率および組換えAAVを接種したHSV感染マウスでの回帰発症予防効果の検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
宿主因子との結合部位を同定するために実施予定であったクロマチン免疫沈降法とシークエンス解析をせずに結合部位の決定が行えたため、それらの実験に必要であった抗体等の試薬類、実験に用いる培養細胞が不要となり、当初予定した使用量が不要になったため。
次年度に繰り越した費用は、動物実験用設備の拡充および組換えAAVの作製・精製に必要な試薬、キット類の購入に使用する。
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