サルコペニアの一次的な原因としての神経筋接合部信号伝達障害の病態機構解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K22802
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 大野 欽司 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (80397455)
• 研究期間 (年度): 2019-06-28 – 2021-03-31
• キーワード: サルコペニア / 廃用性筋萎縮 / 神経筋接合部 / リボタグマウス / 遺伝子発現プロファイル

研究実績の概要

サルコペニアにおける神経筋接合部(NMJ)信号伝達障害が近年注目されており、廃用性筋萎縮を含めてNMJ信号伝達障害はこれら筋萎縮病態の一次的な原因である可能性が示されている。サルコペニアモデルマウスの脊髄運動神経細胞(SMN)とNMJ筋終板において、(i) 細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスを用いた網羅的遺伝子発現プロファイリング解析と、(ii) SPPLAT法によるNMJ筋終板のアセチルコリン受容体近傍に発現するタンパクの網羅的質量分析(proximity proteomics解析)を行い、サルコペニアにより発現が変動するSMN分子・筋終板分子を同定し、CRISPR/Cas9によるノックアウトiPS細胞から構築をしたin vitro NMJ、ならびにCRISPR/Cas9によるノックアウトマウスを作成し、サルコペニアにおけるNMJ病態機構を明らかにするとともに新規治療法開発につなげることを目標とした。
令和元年度は細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスを用いた網羅的遺伝子発現プロファイリング解析を行った。骨格筋特異的MCKプロモータ下にCreを発現するMCK-Creを入手した。神経筋接合部特異的ColQ1aプロモータ下にCreを発現するColQ1a-Creを新たに作成した。脊髄前角細胞特異的にVAChTプロモータ下にCreを発現するVAChT-Creを入手した。これら３種類のCreマウスとRiboTagマウスを交配し、骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現を各群３個体のRNA-seq解析を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

細胞特異的なリボゾームタンパクRPL22へのHAタグの付加を可能にするRiboTagマウスと3種類のCreマウスの交配により骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイルを予定通り明らかにすることができた。

今後の研究の推進方策

老齢マウスにおける骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイルを明らかにする。令和２年度は、SPPLAT法によるNMJ筋終板のアセチルコリン受容体近傍に発現するタンパクの網羅的質量分析(proximity proteomics解析)のセットアップを開始している。サルコペニアにより発現が変動する脊髄前角細胞分子・筋終板分子の機能解析を行うために、CRISPR/Cas9によるiPS細胞のノックアウト実験系を確立している。同時にiPS細胞から構築をしたin vitro神経筋接合部の評価系を構築する。

次年度使用額が生じた理由

RNA-seq解析の低価格下などによりRiboTagマウスを用いた骨格筋特異的・神経筋接合部特異的・脊髄前角細胞特異的な遺伝子発現プロファイル解析が予定よりも安価に行うことができた。iPS細胞培養系・筋分化誘導系に当初の予想よりも高価な試薬が必要であることが判明し令和２年度への予算の繰越を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Desloratadine inhibits heterotopic ossification by suppression of BMP2‐Smad1/5/8 signaling (2021)
  • 著者名/発表者名: Kusano Taiki、Nakatani Masashi、Ishiguro Naoki、Ohno Kinji、Yamamoto Naoki、Morita Mitsuhiro、Yamada Harumoto、Uezumi Akiyoshi、Tsuchida Kunihiro
  • 雑誌名: Journal of Orthopaedic Research 巻: 39 ページ: 1297～1304
  • DOI: 10.1002/jor.24625
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inhibition of cyclooxygenase-1 by nonsteroidal anti-inflammatory drugs demethylates MeR2 enhancer and promotes Mbnl1 transcription in myogenic cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Huang Kun、Masuda Akio、Chen Guiying、Bushra Samira、Kamon Masayoshi、Araki Toshiyuki、Kinoshita Masanobu、Ohkawara Bisei、Ito Mikako、Ohno Kinji
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 2558-2558
  • DOI: 10.1038/s41598-020-59517-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] tRIP-seq reveals repression of premature polyadenylation by co-transcriptional FUS-U1 snRNP assembly (2020)
  • 著者名/発表者名: Masuda A, Kawachi T, Takeda JI, Ohkawara B, Ito M, Ohno K
  • 雑誌名: EMBO Reports 巻: - ページ: e49890
  • DOI: 10.15252/embr.201949890
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Ubiquitination of DNA Damage-Stalled RNAPII Promotes Transcription-Coupled Repair (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa Y, Hara Y, Oka Y, Komine O, van den Heuvel D, Guo C, Daigaku Y, Isono M, He Y, Shimada M, Kato K, Jia N, Hashimoto S, Kotani Y, Miyoshi Y, Tanaka M, Sobue A, Mitsutake N, Suganami T, Masuda A, Ohno K, Nakada S, Mashimo T, Yamanaka K, Luijsterburg MS, Ogi T
  • 雑誌名: Cell 巻: 180 ページ: 1228～1244.e24
  • DOI: 10.1016/j.cell.2020.02.010
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Congenital myasthenic syndrome-associated agrin variants affect clustering of acetylcholine receptors in a domain-specific manner (2020)
  • 著者名/発表者名: Ohkawara B, Shen X-M, Selcen D, Nazim M, Bril V, Tarnopolsky MA, Brady L, Fukami S, Amato AA, Yis U, Ohno K, Engel AG
  • 雑誌名: JCI Insight 巻: - ページ: -
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Effect of zonisamide on acetylcholine receptor cluster at the neuromuscular junction (2020)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Ohkawara B, Nakashima H, Imagama S, Ishiguro N, Ohno K
  • 学会等名: ORS 2020 Annual Meeting (Poster), Phoenix, Arizona, USA
  • 国際学会
• [学会発表] Inhibition of cyclooxygenase-1 by nonsteroidal anti-inflammatory drugs demethylates MeR2 enhancer and promotes Mbnl1 transcription in myogenic cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Huang K, Masuda A, Ohkawara B, Ito M, Ohno K
  • 学会等名: 5th Annual Meeting of Japan Muscle Society (Poster), Tokyo, Japan