| 研究課題/領域番号 |
19K22954
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
三浦 重徳 東京大学, 生産技術研究所, 特任講師 (70511244)
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| 研究分担者 |
宿南 知佐 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60303905)
森本 雄矢 東京大学, 大学院情報理工学系研究科, 准教授 (60739233)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| キーワード | 椎間板 / メカニカルストレス / Pax1 / エンハンサー / 硬節 / MEMS / ３次元培養 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，椎骨と椎間板線維輪の原基である「硬節」で発現する転写因子Pax1の組織特異的な転写制御領域を利用して，椎間板線維輪前駆細胞をマウスより高純度に分離・培養する新たな手法を確立し，線維輪の分化・成熟過程と力学刺激との関連性を明らかにすることを目的とする．
本年度は、我々がこれまでに同定したマウスまたはゼブラフィッシュに由来するPax1硬節エンハンサー配列を用いてGFPをマウス硬節で発現するベクター３種を構築し、トランスジェニックマウス系統樹立のための準備を開始した。マウス系統が樹立できれば、GFPでソーティングすることにより、椎間板細胞またはその前駆細胞を分離することができると考えられる。また、椎間板細胞の力学刺激応答を解析するために、マウスから椎間板細胞またはその前駆細胞を分離・培養する方法について検討を行った。まず、３週齢のマウスから採取した尾椎を用い、組織の処理方法、酵素処理条件、培地などについて検討し、条件の最適化を行った。採取した椎間板細胞は継代によってPax1などのマーカー遺伝子の発現が顕著に低下することはなく、デバイスを用いた力学刺激負荷実験に利用可能であることを確認した。一方、PDMSから成る円形の培養チャンバーとゴム膜を組み合わせ、ゴム膜に空気圧を負荷することでチャンバー内の培養ゲル化組織が膨張し、組織の環状方向に力学負荷を与えることができるデバイスを作製した。本デバイスを用いて椎間板細胞を３次元培養することで、椎間板組織の力学場と類似した力学刺激をin vitroにおいて再現可能であると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
マウス椎間板細胞の分離・培養方法の確立および力学刺激負荷デバイスのプロトタイプの作製についてはほぼ当初の予定通り進んでいる。Pax1エンハンサーを用いたGFPリポーターマウス系統の樹立は、本研究において重要な達成目標の１つであるが、研究環境が大きく変化することが予測されたため実験を保留していた。予備計画も進行中であることから、研究計画全体としては大きな遅延にはつながらないと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、Pax1硬節エンハンサーを用いたGFPリポーターマウスから椎間板前駆細胞を分離・培養し、力学刺激デバイスを用いて培養を行う予定であるが、何らかの原因でトランスジェニックマウス系統の樹立が困難な場合は、マウスの代わりに、ヒトiPS細胞を用いて椎間板細胞へのin vitro分化誘導を行い、椎間板前駆細胞を得る予定である。デバイスにおいて３次元培養して構築した組織は、qPCR、免疫染色などにより解析し、力学刺激と椎間板マーカーの発現との関連性について検証を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究環境が年度の途中で変化する可能性があったため、トランスジェニックマウス作製実験を保留しており、そのため繰越金が発生した。この分は、保留した実験を次年度に加速するために使用する予定である。
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