| 研究課題/領域番号 |
19K23751
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
加藤 大貴 神戸大学, 理学研究科, 助手 (30846994)
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| 研究期間 (年度) |
2019-08-30 – 2022-03-31
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| キーワード | ゼニゴケ / 発生 / シグナル伝達 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではゼニゴケ杯状体形成を制御するWIP転写因子に着目し、A) 発現パターンの解析、B) 機能改変株の表現型解析、C) 下流遺伝子の同定と機能解析を計画している。それぞれの項目について本年度は下記の成果を得た。
A) WIP遺伝子のプロモーター制御下でGUS遺伝子を発現する株を作成してプロモーター活性を調べたところ、葉状体のほぼ全身で強い活性が観察された。一方でWIPゲノム領域にGUS遺伝子を融合したコンストラクトをwip変異体に導入し、機能的なタンパク質の蓄積パターンを調べたところ、頂端ノッチや杯状体内部など限られた領域で蓄積が見られたた。このことからWIPの機能場所は転写後調節により制御されている可能性が示唆された。
B) 前年度に薬剤依存的にWIPの過剰発現を誘導できる形質転換体（XVE>>WIP）を作成した。この株は薬剤による誘導により成長を停止し枯死するという強い表現型を示す。薬剤の濃度を変えて誘導を制御したところ、低濃度の処理においては葉状体の上偏成長、杯状体数の低下などwip変異体とは逆の表現型を示した。
C) 前年度に野生型とwip変異体の１週間目と２週間目の葉状体を用いてRNA-seq解析を行い、それぞれ971遺伝子は共通する発現変動遺伝子を同定していた。本年度はこれに加えてB)で有用性が確認されたXVE>>WIP株を用いたRNA-seq解析を行い、wip変異体データとの比較を行った。その結果、WIPがオーキシンの生合成や輸送を制御するフィードバック制御に関わること、また杯状体形成因子を含む多くの転写因子の発現を制御するハブとして機能する可能性を明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は新型コロナウイルス感染拡大の影響もあり計画に遅れが生じた。特に前半については大学への立ち入りを制限され実験を行うことができない期間が生じた。また参加予定だった国際学会は全て中止され、学会における成果発表とフィードバックを得る機会が少なくなった。実験の進捗についてはA) 発現パターンの解析、B) 機能改変株の表現型解析、C) 下流遺伝子の同定、の3つの研究計画に分けて以下に記述する。
A) GUSレポーター遺伝子を用いた組織レベルでの発現パターンの解析に成功した。一方で蛍光タンパク質をレポーターとした細胞レベルでの解析については、ゼニゴケへの形質転換を複数回行ったものの、過剰発現と思われる表現型異常を示す株しか得られなかった。そこで計画を変更し相同組み換え法を用いたWIPゲノム領域への蛍光タンパク質ノックインを試み、組み換え体の単離に成功した。
B) 薬剤依存的な過剰発現株について、誘導する薬剤の濃度を下げることにより、解析が困難な枯死するという表現型を回避しつつ、変異体と逆向きの表現型を引き起こすことに成功した。しかし、杯状体形成過程における細胞分裂面についての解析は他の計画を優先して時間を費やしたため、遅れが生じている。
C) 機能欠損変異体と過剰発現株の両方を用いたRNAシーケンス解析を計画通りに完了し、WIPの下流因子候補を同定することに成功した。下流因子候補の中には杯状体形成への関与が示されている転写因子や、細胞分裂面制御への関与が予測される因子も見つかった。
以上のように当初の計画からは遅れと変更が生じているが、延長された次年度において挽回可能であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度の研究計画についてA) 発現パターンの解析、B) 機能改変株の表現型解析、C) 下流遺伝子の同定、の3つの研究計画に分けて以下に記述する。
A) WIPの発現組織について細胞レベルでの解析を行うため、相同組み換え法により蛍光タンパク質をWIPゲノム領域にノックインした株の観察を行う。
B) これまでに作成した機能欠損変異体と誘導的過剰発現株を用いて、杯状体形成における細胞分裂面についての表現型を観察する。手法は当初予定していたPseudo-Schiff染色に代えて、ClearSee法による透明化とSCRI Renaissance 2200を用いた細胞壁染色を組み合わせた方法を用いる。この方法は前者に比べて簡便、かつ蛍光タンパク質のシグナルも同時に観察することが可能である。得られた結果を計画A) の結果と照らし合わせることで杯状体形成におけるWIPの機能モデルを明らかにする。
C）RNA-seq解析から得られたWIP下流因子の候補について、細胞分裂面制御への関与が考えられる因子に着目し、定量的RT-PCR実験による発現の確認とCRISPR/Cas9法を用いた機能欠損変異体の作出を試みる。
新型コロナウイルスの流行は現在も続いているが、学会についてはオンライン開催の普及により交流の機会が回復しつつある。状況に応じた方法により国内外の研究者から研究成果へのフィードバックを得た上で、国際誌における成果発表を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究は２年間の研究期間で計画されていた。しかし、本年度は新型コロナウイルス感染拡大の影響もあり、研究計画の遅れや国際学会の中止が生じたために、当初の計画よりも使用額が少ないものとなった。未使用分について次年度では遅れている研究計画を進めるための消耗品購入、国内外研究者からフィードバックを得るための学会参加費、国際誌における論文発表のための投稿料や英文校閲の謝金として使用する。
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