| 研究課題/領域番号 |
19K23823
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
加藤 耕治 名古屋大学, 環境医学研究所, 特任助教 (40844056)
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| 研究期間 (年度) |
2019-08-30 – 2024-03-31
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| キーワード | レトリーバー複合体 / VPS35L / エンドソーム / 脂質異常症 |
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| 研究実績の概要 |
我々は中枢神経系、筋骨格系、心臓などの組織に先天性形成異常を呈した家族例から、VPS35L遺伝子に両アレルの機能喪失型変異を同定し、新規のRitcher-Schinzel症候群（別名3C症候群）の新規の原因遺伝子として報告した（2020、J Med Gent）。VPS35LはVPS29、VPS26Cよりなる三量体のRetriever複合体のコアタンパクである。このRetriever複合体はエンドソームにおいて細胞膜タンパクのリサイクリングにおいて重要な役割を果たし、主にNPXYモチーフを有する細胞膜タンパクの発現量を維持する役割を担う。従って、VPS35Lを細胞株で欠損させることにより、それらの細胞膜タンパクの発現量が低下する。
VPS35Lに関連する3C症候群の臨床像の理解を深めるため、本研究期間中に国際共同研究により症例集積を務め、同様の症状を有する患者のエクソーム解析により新たに3症例を同定し、臨床的な多様性に関して報告した（2023、J Med Genet）。
これら臨床的特徴の背景に存在する分子メカニズムを明らかにするため、VPS35L欠損細胞株を作成した。特に患者で幼少期からみられた脂質異常症の分子学的背景を明らかにするため、NPXYモチーフを有するLRP1、LDLRに着目した。VPS35L欠損細胞では両蛋白の細胞膜における発現量の低下を認め、そのため細胞内へのLDLの取込みの低下を認めた。患者で見られた脂質異常症はこのメカニズムにより脂質の細胞内への取込みが障害された結果と考えられた（2023、J Med Genet）。
また、個体レベルではVPS35Lの完全欠損マウスは胎児期早期（E7.5-E8.5）に死亡することを明らかにし、患者変異ノックイン（KIマウス）、中枢神経・筋骨格系組織特異的VPS35L欠損マウスモデルを作製し、3C症候群類似の表現型を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
国際共同研究により4家系5症例のRetriever複合体機能不全症例を集積し、患者表現型の比較、変異体の機能解析、脂質異常症の分子病態に関して報告することが出来ており、その点においては当初の計画通りに順調に進展していると考えている。2023年の論文発表後も更に症例の集積が出来ており、Retriever複合体機能不全により引き起こされる疾患の全体像をより詳細に理解できると考えている。
一方で、マウスの解析に関しては予定よりやや遅れが出ている。これは一つには新型コロナウイルス感染症に伴い実験作業に制限が生じたこと、ウクライナ侵攻に伴う国際物流の停止により物品の入手が困難になったこと、また国際共同研究のための冷凍サンプル送付が困難になった点が挙げられる。現在は社会情勢としては好転しているが、次の問題としてKIマウスの個体が得られなくなったことが挙げられる。KIマウスをB6に戻し交配を行ったところ、F1交雑系では得られていたKIのホモ接合マウスが得られなくなった。従って、現在は改めて交雑系に戻すことで個体が得られるかどうか確認を進めている。個体が得られれば、改めて腎泌尿器系・神経系・筋骨格系などに関連した解析を進めて行く。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．臨床的な側面に関しては、更なる症例の集積により、臨床像の理解に努めていく。2023年の論文発表後、現時点で既に2症例の追加集積を出来ており、今後疾患概念が周知されるに伴い更に症例数は増加すると考えている。
２．細胞を用いた解析に関しては、VPS35L欠損細胞を用いてRetriever複合体の機能不全によりどの様な膜蛋白の発現変化が生じているのかを明確にし、様々な表現型の原因となっている膜蛋白を同定していく。この膜蛋白の同定には細胞膜分画を用いたプロテオーム解析を用いる。同定された膜蛋白に関しては、発現変化をWBで確認するとともに、免疫沈降によりVPS35Lやそのアダプター蛋白（SNX17）との相互作用、細胞免疫染色によるライソソームへの蓄積を証明することにより、リサイクル不全の病態を明確にする。
３．KIマウス、組織特異的VPS35Lを用いて、患者・マウスで見られている表現型の組織学的原因、分子学的原因を明らかにする。脂質異常症のLRP1、LDLR同様、蛋白尿、中枢新鋭合併症、先天性心疾患の原因に寄与し得る膜蛋白を幾つか細胞レベルで同定している。これら膜蛋白の発現変化と機能不全を個体レベルで証明することにより、Retriever複合体の機能不全による3C症候群の病態を明らかにし、今後の最適な患者のフォローアップや治療法開発へと繋げる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルスの流行、ウクライナ情勢によるサンプル輸送の障害の外的要因、KIマウスの個体が得られないという内的要因により研究に一部遅れがあり、次年度使用が生じた。
次年度使用分の使用計画としては、KIマウスの個体が得られた時点で組織切片の作成や免疫染色に用いる抗体などの購入費用とする予定である。
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