2019 年度実施状況報告書

ヒト多能性幹細胞からの内耳血管条辺縁細胞分化誘導系の確立

研究課題

研究課題/領域番号	19K24038
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	三枝智香慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任助教 (00280800)
研究期間 (年度)	2019-08-30 – 2021-03-31
キーワード	多能性幹細胞 / 内耳 / 血管条 / 辺縁細胞 / 3Dオルガノイド / 2D細胞シート / 上皮細胞 / バリア機能
研究実績の概要	ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）から血管条辺縁細胞への分化誘導条件を検討した。３D（otosphere）の状態で栄養因子などを添加しながら約20日間培養し、ｑPCRや免疫染色でマーカー遺伝子の発現を解析した。その結果、辺縁細胞マーカーであるKCNQ1、PAX2、HGFやタイトジャンクションタンパク質であるZO-1、Occludin、 Claudin-1などの発現を認めた。しかしながら同時にOTX2やVmoIといったReisner membraneマーカーも発現していた。培地添加物を数種類検討した結果、OTX2の発現をある程度抑制する条件を見出すことができた。また分化誘導した３D-otosphereを4kDa-FITC-Dextranが透過できなかったが、３D-otosphereをEDTA処理することで透過できるようになった。このことから３D-otosphereは上皮細胞特有のCa+依存的なバリア機能を有していることが示唆された。 3D-otosphereから２D細胞シートを作製する目的で、3D-otosphereを酵素処理により単細胞化し、transwell filter上に再播種した。市販の酵素を用いて単細胞化していた当初は再播種後の細胞死が顕著であったが、市販酵素液にEDTAを添加して単細胞化する・再播種直後にはROCK inhibitor Y-27632を添加する、などの条件で培養することで細胞生存率を上げることができた。再播種後の細胞において、NaK ATPaseなどの発現を免疫染色で確認できた。以上の結果より、引き続き分化誘導条件の検討を必要とするものの、内耳上皮細胞である血管条辺縁細胞に近い細胞を分化誘導できていると考えている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）から分化誘導した３D-otosphereにおいて血管条辺縁細胞マーカーの発現を認めることができた。しかし他細胞のマーカー遺伝子をも発現してしまっており、血管条辺縁細胞への分化誘導は未だ十分ではないと考えられる。内在血管条辺縁細胞により近付けるための分化誘導条件の検討が引き続き必要である。 2D細胞シート作製については細胞の生存率を上げることはできたが、細胞がheterogenousであることから、2Dシートを用いてバリア実験・イオン透過実験などを行うには至っていない。
今後の研究の推進方策	ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）から血管条辺縁細胞へ分化誘導する目的で、転写因子強制発現系を試みる。辺縁細胞の発生分化に重要であることが示唆されている核内転写因子を分化誘導時に強制発現させることで辺縁細胞を効率よく分化誘導できるのではないかという作業仮説を検証する実験を行う。さらに分化誘導のための転写因子と同時にGFP遺伝子をも発現させ、GFPシグナルを指標に辺縁細胞様細胞に分化した細胞を分離する。この操作により辺縁細胞様細胞を濃縮することが可能であり、分化誘導した細胞がheterogenousであるという問題を解決できる可能性があると考えている。また、内在辺縁細胞は中間細胞と接し、細胞間で密接な情報交換を行っている。中間細胞はメラノサイト由来であることから、分化誘導過程のiPS由来辺縁細胞様細胞をメラノサイトと共培養することでより内在の環境に近い条件下で培養できる可能性があると考えらえる。共培養下で辺縁細胞の分化誘導を行った後、マーカータンパク質の発現・局在などを解析することで共培養系を評価する。上記の方法により、効率よく辺縁細胞を分化誘導できた際には、シスプラチン毒性機序の解析・薬剤スクリーニングなどを行う予定である。
次年度使用額が生じた理由	培養条件が確立するまでは海外の学会発表は差し控えたほうがよいという理由で海外の学会参加を見送った。また、培養に必要な消耗品・試薬などは研究室にこれまでストックされていたものを効率よく使用した。以上の理由から次年度使用額が生じた。次年度には細胞培養に必要な高額試薬・消耗品の購入、共焦点顕微鏡やマイクロプレートリーダー・FACSなどの機器使用料、論文発表のための英文校正費、国内外の学会参加費として使用する予定である。