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本研究では新たに作製した、OFF経路の反応を再現するキメラロドプシンGtACR2/BvRhを、網膜色素変性症モデルマウスに遺伝子導入することでOFF経路視覚再生モデルマウスの作製し、電気生理学的・行動学的に視覚再生効果の検証を行う。
まず、OFF経路の反応を再現するキメラロドプシンGtACR2/BvRh について、哺乳類への塩基配列の最適化を実施しAAVベクターの作成を行った。
OFF経路と同時に用いるON経路視覚再生については、本年度in vitroでの薬理学的作用の確認を実施し、そのGタンパク質刺激能が確認できた。また、AAVの血清型による視覚再生効果の検討を実施した。明暗箱試験や物体認識試験の結果、ターゲットになる細胞への感染効率が高いものほど視覚再生効果が高いことが確認された。また、遺伝子組換えマウスを用いた視覚再生実験の結果からアマクリン細胞も含めた視覚再生の有効性が明らかとなった。
また、暗刺激のための、MEAの光刺激系の構築、予防効果の確認の目的で、レチノイド分析手法の確立を行った。
具体的には網膜サンプル中のAll-trans-retinalと11-cis-retinalの定性的な分析を実施できるようになった。これによって網膜中のAll-trans-retinalと11-cis-retinalの存在比を測定することが可能となった。
系の立ち上げの中で、オキシム法による網膜サンプルからのレチナール抽出方法の最適化、カラムの検討、HPLCの条件検討を実施し、1網膜からでもAll-trans-retinalと11-cis-retinalを鋭敏に検出できる最適な条件を見出した。
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