| 研究課題/領域番号 |
19KK0185
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
橋本 哲男 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50208451)
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| 研究分担者 |
久米 慶太郎 筑波大学, 医学医療系, 助教 (70853191)
千葉 洋子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 研究員 (70638981)
神川 龍馬 京都大学, 農学研究科, 准教授 (40627634)
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| 研究期間 (年度) |
2019-10-07 – 2023-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア関連オルガネラ（MRO） / プロテオミクス / フォルニカータ / 嫌気環境適応 / 機能進化 |
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| 研究実績の概要 |
実験研究においては、MROの精製とプロテオミクス解析の対象とするフォルニカータ6生物種のうち、Kipferlia, Dysnectes (以上、橋本研), Carpediemonas (Roger研) の3生物種に関する解析を行った。
解析が最も進んでいるKipferliaについては、R1年度に行ったiTRAQ法によるMROのプロテオミクス解析の再解析を行った。密度勾配遠心による細菌除去と浸透圧ショックによる細胞破砕を特徴とする新規の手法で細胞分画を行い、密度勾配超遠心による細胞分画後の各タンパク質の勾配内の分布情報をもとに96の推定MRO局在タンパク質を解析的に特定した。そして、 KipferliaのMROがTrichomonasのMRO同様に、エネルギー代謝、水素生成、 NADH再酸化、酸化ストレス応答、鉄硫黄クラスター合成、グリシン開裂を行うことが示唆された。このことから、パラバサリアとフォルニカータの共通祖先では、 KipferliaのMROとTrichomonasのMROとで共通する機能にまで MROの機能が既に縮退していた可能性が高く、その共通祖先から KipferliaやTrichomonasに 至る過程では大きな機能縮退は起きなかったことが示唆された。また、Dysnectesについては、MROのマーカーとなるシャペロニン(CPN60)に特異的な抗CPN60ペプチド抗体の作製に成功し、Kipferliaでの方法を模倣するために、Dysnectesにおける細胞分画の条件検討を進めた。一方、Roger研においては、ChilomastixにおいてKipferliaと同様の方法でMROのプロテオミクス解析を進めるための準備を行った。
解析研究においては、2019年度に引き続きミトコンドリア・MRO関連タンパク質の一部についてホモログを探索し分子系統解析を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
R2年度は、密度勾配遠心による細菌除去と浸透圧ショックによる細胞破砕の後、密度勾配超遠心による細胞分画を行い、KipferliaのMROのプロテオミクス解析に成功した。これにより、餌細菌との混合培養系で維持されている自由生活フォルニカータにおいて、初めてMROのプロテオームを明らかにすることができた。真核生物全体を見ても混合培養系からのミトコンドリアの精製・プロテオミクスに成功した初めての例である。この成果は画期的であり、同様の方法論が解析対象としている他のフォルニカータ生物に対しても適用可能であるため、研究活動は順調に展開されていると考えられる。
一方、MROのプロテオミクス解析の基盤となるゲノム・トランスクリプトームデータの整備に関しては、R1～R2年度を通して、既報のKipferliaと未着手のRetortamonasを除く4種についてほぼ完了している。生物種による進行度合いの違いはあるものの、最も重要な遺伝子発見の部分については、一般的なバイオインフォマティクスプログラムによる処理が終わっている。今後マニュアルによる精査が必要ではあるものの、順調な進捗状況と考えられる。
分子系統解析に関しては、ミトコンドリア・MRO関連タンパク質のうち、嫌気的ATP合成、NADH再酸化、鉄・硫黄クラスター合成、水素生成に関与するタンパク質の解析がほぼ終了しており、順調な状況にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
R2年度に引き続き、フォルニカータ生物6種を対象に、MROの機能の進化を推測するための基盤データの取得に関する実験研究とそれによるオリジナルデータを含めたデータ解析研究を進める。
とくにR3年度の実験研究においては、R2年度にKipferliaを対象に確立することができたMROの精製とプロテオミクス解析に関する方法論を、他のフォルニカータ生物にも適用して、他生物のMROプロテオームのデータを得る。橋本研・千葉研において、Dysnectesに関し同様の方法論を用いて解析を進める。Roger研ではR2年度にChilomastixに関する高品質なゲノム・トランスクリプトームデータを取得することができ、MROのプロテオミクス解析の準備ができたため、橋本研・千葉研での方法論・技術をRoger研に移転しChilomastixにおけるMROの精製とプロテオミクス解析に挑戦する。さらに、KipferliaおよびR3年度内にMROのプロテオームのデータを得る予定であるDysnectes, Chilimastixについて、MROタンパク質を3個程度選びそれらに対する抗体を作製し、免疫蛍光抗体法によりそれらのタンパク質が確かにMROタンパク質であることを証明する。
R4年度は、R3年度までの成果に基づき、残りの3生物、Aduncisulcus, Carpediemonas, Retortamonasに関する解析を進め、MROのプロテオームに関する基盤データの蓄積を完了する。
一方、随時データの収集に努め、本課題におけるオリジナルデータと併せて分子進化学的解析が行える体制を維持していく。このような方策により、今後、実験・データ解析の両面からミトコンドリア/MROの進化過程の全体像を明らかにし、嫌気環境適応によるミトコンドリア機能の縮退進化やMRO機能の進化にどのような多様性・普遍性があるかを探っていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R2年度末に、新型コロナウイルス感染症蔓延に伴う物品納品の遅れが見込まれたため、実験研究およびデータ解析研究に必要となる消耗品の一部について、R3年度以降に購入することとした。次年度使用額については、主として物品費として使用する予定である。
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