植物におけるストリゴラクトン生合成及びその調節機構の解明

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19KK0395
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 米山 香織 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (20769997)
• 研究期間 (年度): 2020 – 2023
• キーワード: ストリゴラクトン

研究実績の概要

ストリゴラクトンは、植物の生長・分化を制御する、農業生産においても注目度が高い、極めて重要な二次代謝産物である。本研究では、多様なストリゴラクトンの機能のうち、地上部枝分かれ抑制活性に着目して、シロイヌナズナのストリゴラクトン生合成経路の全貌及び活性本体、更にその調節機構の解明を目指す。申請者はこれまでに、シロイヌナズナの新奇ストリゴラクトン生合成関連遺伝子として単離した、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードしているLATERAL BRANCHING OXIDOREDUCTASE (LBO)の酵素機能を明らかにした。一方、シロイヌナズナの地上部枝分かれ抑制活性本体の生成には、LBO以外の酵素が関与している可能性が示唆された。海外共同研究者であるDavid Nelson准教授（米国・カリフォルニア大学リバーサイド校）によると、分子系統解析から、シロイヌナズナには、LBOに近接したクレードに機能未知の４つのジオキシゲナーゼが存在し、そのうち２つは、ストリゴラクトンの主要な生合成部位である根で強く発現している。そこで国内では大腸菌発現系を用いて新奇ジオキシゲナーゼの酵素機能を明らかにすることにした。
本年度は、2022年2月中旬から渡米し、Nelson研究室に11ヶ月間籍をおいて研究を行うことができた。CRISPER/Cas9を用いて、シロイヌナズナの二重、三重、四重変異体の作成、それぞれのシングル変異体を用いて交雑による二重変異体作成などを試みた。それらに加えて、新奇植物ホルモンの同定のためのバイオアッセイを確立し、さらに、RNAseqのドライ解析方法について学んだ。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2022年2月中旬から2023年1月まで、University of California, Riverside校のDavid Nelson博士の研究室に客員研究員として滞在することができた。CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により、シロイヌナズナの新奇ストリゴラクトン生合成候補遺伝子のノックアウトライン作成を試み、SALKから取り寄せたシングル変異体を利用して、二重、三重、四重変異体を作成することができた。現在はこれら変異体の地上部枝分かれ表現型の詳細な調査を行なっている。また、4つある新奇ストリゴラクトン生合成候補タンパク質の大腸菌発現系の構築は完了させたが、その基質は不明であるため、それら変異体に蓄積する前駆体候補となるストリゴラクトンの単離・同定も行う必要がある。
一方、Nelson氏は、ストリゴラクトン受容体ホモログであるKAI2に関する研究に造詣が深い。しかしそのリガンドはまだ不明であることから、今回、KAI2リガンドが蓄積していると予想されるNelson氏のグループが作出したシロイヌナズ受容シグナル伝達変異体を用いて、KAI2リガンドの単離同定を試みることになった。新奇化合物の単離同定のためにはまず、簡便で感受性、特異性が高いバイオアッセイが必要となるが、そのアッセイ方法を確立することができた。現在はナズナ抽出物を分画し、どの画分に活性が認められるのかを確認している。さらに、米山がこれまで得られたRNA-seqデータのドライ解析方法を基礎から習うことができた。

今後の研究の推進方策

今回CRISPR/Cas9を用いて作出したシロイヌナズ変異体には、地上部枝分かれ以外の表現型も予備試験で認められたため、再現性の確認を含め、詳細な解析を行う。また大腸菌発現系や無細胞翻訳系を用いた代謝実験により、代謝物の単離・同定も進める。今年度中に投稿論文としてまとめたい。
ストリゴラクトンの生合成・分泌調節メカニズムの解明につながる実験系において得られたRNA-seqデータのドライ解析を進め、投稿論文としてまとめる。基本的なバイオインフォマティクス技術も獲得することができたため、多様なストリゴラクトンの生合成の鍵であると示唆されているCYP722Cと、様々な植物種から同定した多様なストリゴラクトンの分布の相関性の解析を進める。さらには、KAI2のリガンド探索も行う。

研究成果

• [雑誌論文] Ancestral sequence reconstruction of the CYP711 family reveals functional diverfence in strigolactone biosynthetic enzymes associated with gene duplication events in monocot grasses (2022)
  • 著者名/発表者名: Vinde MH, Cao D, Chesterfield RJ, Yoneyama K*, Gumulya Y, Thomson RES, Matila T, Ebert BE, Beveridge CA, Vickers CE, Gillam EMJ
  • 雑誌名: New Phytol 巻: 235 ページ: 1900-1912
  • DOI: 10.1111/nph.18285
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Ancestal function of strigolactones as symbiotic rhizosphere signals (2022)
  • 著者名/発表者名: Kodama K, Rich MK, Yoda A, Shimazaki S, Xie X, Akiyama K, Mizuno Y, Komatsu A, Luo Y, Suzuki H, Kameoka H, Libourel C, Keller J, Sakakibara K, Nishiyama T, Nakagawa T, Mashiguchi K, Uchida K, Yoneyama K*, Tanaka Y, Yamaguchi S, Shimamura M, Delaux P, Nomura T, Kyozuka J
  • 雑誌名: Nat. Commun 巻: 13 ページ: 1-15
  • DOI: 10.1038/s41467-022-31708-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Environmental strigolactone drives early growth responses to neighbouring plants and soil volume in pea (2022)
  • 著者名/発表者名: Wheeldon CD, Hamon-Josse M, Lund H, Yoneyama K*, Bennett T
  • 雑誌名: Curr. Biol 巻: 32 ページ: 3593-3600
  • DOI: 10.1016/j.cub.2022.06.063
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Supra-organismal regulation of strigolactone exudation and plant development in rice in response to rhizospheric cues (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoneyama K*, Xie X, Nomura T, Yoneyama K, Bennett T
  • 雑誌名: Curr. Biol 巻: 32 ページ: 3601-3608
  • DOI: 10.1016/j.cub.2022.06.047
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Extraction and Quantification of Plant Hormones and RNA from Pea Axillary Buds (2022)
  • 著者名/発表者名: Cao D, Barbier F, Yoneyama K *, Beveridge CA
  • 雑誌名: Bio-protocol 巻: 12 ページ: 1-8
  • DOI: 10.3389/fpls.2020.605069
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著