研究課題
神経伝達物質はシナプス小胞内に濃縮・蓄積された後、開口放出によって細胞外へ放出される。その後ターゲットとなる細胞の受容体に結合する事でシグナルを伝達している。シナプス小胞には様々なタンパク質が存在し、神経伝達物質の蓄積や開口放出に関わっている。V-ATPase(H+ポンプ)はATP加水分解のエネルギーを利用して、H+を小胞内に輸送する。これによって形成された小胞内外のH+の電気化学的勾配を利用して、小胞型神経伝達物質トランスポーターが伝達物質を小胞内に輸送している。これまでの単離シナプス小胞を用いた解析により、シナプス小胞に存在するタンパク質の概要が明らかになってきた。しかし、シナプス小胞の機能には未だ不明な点が多い。本研究では化学伝達機構解析の基盤とするために、精製タンパク質を用いた人工的なシナプス小胞を開発した。神経伝達物質トランスポーターとして、小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGLUT)、小胞型ヌクレオチドトランスポーター(VNUT)、小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター(VEAT)、小胞型モノアミントランスポーター(VMAT)および小胞型GABAトランスポーター(VGAT)の大量発現・精製系を構築した。さらに、開口放出に必要な因子である、PSフリッパーゼ(ATPaseII)、シナプス小胞タンパク質(SV2)も同様に精製した。V-ATPaseの代わりにバクテリア由来のF-ATPaseを精製しH+ポンプとして用いた。これらのタンパク質をともにリポソーム中に再構成したところ、再構成膜小胞はATPを添加する事で神経伝達物質を輸送した。この輸送の生化学的特徴は単離シナプス小胞と同模であった。本研究により開発した人工シナプス小胞は神軽化学伝達の分子機構を理解する上で、必須なツールとなるものと期待している。
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