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D-pathwayは、ウシと細菌のチトクロム酸化酵素に共通に認められ、酸素還元部位と、膜内側酵素分子表面とを連結する水素結合ネットワークである。X線構造は、水形成用プロトンの輸送経路であることを示唆する。細菌酵素の変異体解析により、この経路は、水形成用とポンプ用プロトンとを共に輸送すると提案されている。ウシ酵素D-pathwayの機能を検討するために、細菌酵素で酸素還元活性を消失させたAsp91Asn、Glu242Gln、Gly160Asp変異体と、ポンプ活性のみを消失させたAsn98Thr、Asn163Asp変異体の作製を試みた。変異をウシサブユニットI遺伝子に導入し、発現ベクターを構築して、ヒト培養細胞であるHeLa細胞に導入した。抗生剤を添加した選択培地で生育する細胞が発現ベクターを安定に保持する細胞である。選択培地で生育する細胞クローンを、それぞれ3-5つ選択できた。しかし、変異体酵素の発現と、ウシヒト雑種酵素の機能を評価するまでには至らなかった。
上記ヒト培養細胞発現系は、ウシチトクロム酸化酵素サブユニットIを強制発現させると、ウシ・ヒト雑種酵素をミトコンドリア内に形成する。しかも、雑種酵素が内因性ヒト酵素より優先的に発現する。ミトコンドリアをMito Tracker Green FMで染色し、コンフォーカル顕微鏡で、そして固定した細胞を電子顕微鏡で、それぞれ観察した。HeLa細胞ミトコンドリアは細胞内にほぼ均一に分布していた。この分布相は野生型の正常雑種酵素を発現させても顕著な変化を示さなかった。しかし、H^+ポンプ能を失った変異体雑種酵素(Asp51Asn変異酵素)を発現させると、核周辺にミトコンドリアが集まった像が観察された。この結果は、細胞内でのミトコンドリアの分布にH^+ポンプ活性が影響を持つ事を示し、ポンプ活性に新たな生物学的意義が示唆された。
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