研究課題
(1) p45による転写活性化機構の検討p45のアミノ末端領域が転写活性化ドメインとして機能することが、培養細胞への一過性遺伝子導入実験により示されている。そこで、p45が実際に生体内で機能している巨核球において、p45の機能、特に、転写活性化能に必須のドメインを明らかにするために、p45欠失変異体p45△1-38を巨核球において発現するトランスジェニックマウスを作成した。同マウスをp45欠損マウスと交配して得られる複合変異マウスは、p45欠損マウスと同様に、血小板減少、胞体突起形成障害を示した。また、p45の標的遺伝子の発現も低いままであった。このことから、p45のアミノ末端領域1-38は、その転写活性化能に必須であることが明らかになった。(2) MafGC末端領域 (Maf-CTR) に結合する因子の精製と同定Maf-CTRは、NF-E2の転写活性化能に必須であり、核マトリックス結合シグナルとして機能する。そこに結合する因子は、核マトリックスの構成成分であることが予想されることから、強力な蛋白質変性作用を有する尿素を用いて、核マトリックスを可溶化する必要がある。そのために、蛋白質相互作用をあらかじめ架橋剤により共有結合化し、変性条件下でも有効なアフィニティー精製法としてHis-tagとNi-NTAの結合を利用し、核マトリックスから複合体の精製を試みた。His6よりもNi- NTAと親和性が高いHis12タグを利用し、収量を改善した。また、特性を上げるために、変性条件下でNi-NTAによるpull-downのあと、蛋白質をリフォールディングさせて、第2のタグ、HAタグにより免疫沈降をおこなうことにより、精製度を改善しつつある。
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生化学 (印刷中)
Mol. Cell. Biol 28
ページ: 2758-2770
