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これまでの孔辺細胞を用いた研究により、細胞膜H+-ATPaseは、C末端スレオニン残基のリン酸化とリン酸化部位への14-3-3蛋白質の結合により活性化されることが明らかとなったが、このリン酸化反応に関わるプロテインキナーゼやホスファターゼは、未だ明らかとなっていない。そこで、まず、シロイヌナズナの黄化芽生えから、水性二相分配法により単離した細胞膜画分を用いてin vitroでリン酸化反応系の確立を行った。その結果、ATPを加えただけではH+-ATPaseのリン酸化は検出されなかったが、14-3-3蛋白質とリン酸化C末端の結合を安定化し脱リン酸化を阻害するカビ毒素フシコクシンをATPと同時に加えることにより、H+-ATPaseのC末端のリン酸化が検出されることが明らかとなった。
次に、in vitroでのH+-ATPaseの脱リン酸化反応を調べた結果、脱リン酸化が観察され、H+-ATPaseを脱リン酸化するホスファターゼも細胞膜に局在していることが示唆された。さらに、ホスファターゼ阻害剤を用いて脱リン酸化反応を行なった結果、EDTA存在下で脱リン酸化が阻害され、H+-ATPaseの脱リン酸化に関わるホスファターゼとして二価カチオン要求性のタイプ2Cプロテインホスファターゼ(PP2C)の関与が示唆された。
さらに、H+-ATPaseの免疫沈降物におけるH+-ATPdseの脱リン酸化反応を調べた結果、興味深いことに、H+-ATPadeの脱リン酸化が観察された。この結果は、免疫沈降物中にH+-ATPaseを脱リン酸化するホスファターゼが存在することを示唆している。そこで、H+-ATPaseの免疫沈降物のSDS-PAGE解析を行った結果、H+-ATPaseと共同沈降する蛋白質が少なくとも7個存在することがわかった。
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