| 研究概要 |
染色体DNAの複製において、複製タンパク質は複製開始領域に集合し、何らかの変化を起こし、DNA合成反応を始める。これをリモデリングと捉え、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて解析を進めている。今期は、精製タンパク質からの再構成による単位反応の解析に加えて、出芽酵母粗抽出液によるin vitro複製系を用いた解析も始めた。粗抽出液を用いた系では、複製に関与するヘリカーゼ(Cdc45-MCM-GINS複合体)構成因子の複製開始領域への結合を指標として調べたところ、細胞内で観察される順番で結合する条件を見いだした。この構成因子の1つGINSは、DNAポリメラーゼε(Polε)との結合を介してpre-Loading complex(pre-LC)を形成し、複製開始領域へ結合する。Polεはリーディング鎖の合成を行うポリメラーゼであり、Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4の4つのサブユニットから成る。Pol2が触媒サブユニットであるが、このサブユニットのN末に位置するポリメラーゼドメインを欠失することが可能である。しかし、このサブユニットのC末領域は必須である。このC末領域はDpb2,Dpb3,Dpb4サブユニットと結合する領域である。実際に、Dpb2の量が減少している変異ポリメラーゼやPol2サブユニットのN末を欠くPolεを精製しGINSとの結合を調べたところ、GINSとPolεの結合がDpb2サブユニットに依存し、Pol2のN末領域には依存しないことが分かった。一方、複製因子Sld3はSld7と結合し2量体を形成する。この構造が複製開始領域から両方向に複製を開始する上で重要であると考え、解析を進めている。現在までのところ、実際にSld3が2量体構造を敢っていること、Sld7のN末領域がSld3のN末領域に結合することが分かった。
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