| 研究概要 |
細胞内合成途上peptidyl-tRNAを検出し、その動的全体像を観察する実験方法を開発した。polypeptidyl-tRNAのpolypeptideとtRNA間エステル結合を保持するneutral PH条件下で一次元目の電気泳動を行い、切り出したゲルレーンをエステル結合加水分解条件で処理した後に二次元目の泳動を行うため、ペプチドとtRNAを結合するエステル結合の安定性に関して系統的に調べた。その結果、加水分解を受けにくいpeptidyl-tRNA(最後のアミノ酸がIle, Val, Pro, (Asp)の場合)が存在することが明らかとなった。このような、polypeptidyl-tRNAを加水分解するが、電気泳動に悪影響を与えない条件を見いだし、2次元電気泳動法を確立した。正常な(完成した)タンパク質は対角線状に泳動されるが、対角線の下側に合成途上鎖のラインを観察することに成功した。この方法を用いてpolypeptidyl-tRNAのchemical amountはごく微量であること、中間体としてのpolypeptidyl-tRNAをパルスチェイス実験と組み合わせて追跡することができること、リボソーム救出機構欠損変異株中ではデッドエンド状態のpolypeptidyl-tRNAが蓄積することなどを明らかにした。また、翻訳アレストを起こすモニタータンパク質のアレスト配列の特異性とN末端側センサー部位との組み合わせについて、in vitro, in vivoの解析を行い、アレスト配列は個別性の高い方式でリボソームに働きかけるが、異なるセンサー部位と組み合わせることにより、多様な細胞機能を監視できることを見いだした。
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