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C37BL6マウスの洞房結節および右心房からmRNAを採取した。次にアジレント社製マイクロアレイを使用して遺伝子発現プロファイルを網羅的に比較した。洞房結節で有意に発現量の高い転写因子を28種、洞房結節で有意に発現量が低い転写因子を16種同定した。このうち洞房結節で発現量が多い上位4種類の転写因子X(未発表データ)、lsl1、Tbx18、Shox2のcDNAをクローニングした。
これらの分子のC端に蛍光蛋白質を融合したコンストラクトを作成した。これをAdenovirus vectorによって培養ラット心筋細胞に遺伝子導入した。その後mRNAを採取し、real time PCRによってペースメーカー細胞のマーカーであるHCN4遺伝子の発現量を測定した。上記の転写因子を単独で培養心室筋細胞に発現させた場合、HCN4の発現量は増加しないか、逆に低下することが明らかになった。培養心房筋細胞でも同様の結果であった。これらの転写因子全て、ない複数を組み合わせて共発現させた場合もHCN4の発現量に有意な変化はなかった。
次に洞房結節での発現量が低い転写因子Nkx2.5とNRSFについて遺伝子ノックダウンを実施したところ、NRSFをノックダウンした場合のみ、2倍程度の発現上昇が認められた。NRSFノックダウンに加えてShox2およびXを過剰発現すると、Hcn4の発現はそれぞれ6倍および8倍、上昇することを発見した(投稿準備中)。
この条件下でHcn4プロモーター領域と、エンハンサー配列を連結したコンストラクトを同時に遺伝子導入し、エンハンサー活性の上昇する領域を絞り込んでいる。現在までに近位プロモーターの活性がShox2によって上昇することを見いだした(投稿準備中)。
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