| 研究概要 |
高感度・高S/N比の座位別増幅型多色SNP検出技術を開発するため、研究分担者が開発した新規蛍光物質を、代表者らが開発した遺伝子増幅法であるSmartAmp法に導入しようと考えた。結果、プロダンとは少し異なるが、同じく分担者が開発した新規蛍光物質(チアゾールオレンジ,510/530nm)を、SMAP法に導入した。これは蛍光物質をプライマーのチミン部位に導入するもので、二本鎖の間隙に入り込んで蛍光を発するSYBR Greenとは異なり、プライマーが新規に標的シーケンスとアニーリングした時だけ発光するため、狙い通り非特異的なバックグラウンドが大幅に抑制され、非常に強いシグナルを得ることができた。またこの蛍光物質は、SmartAmp法で使用する3種のSNP認識プライマー、TP(Turnback Primer)・FP(Folding Primer)・BP(Boost Primer)すべてに導入することができ、その全ての例においてタイピングあるいは変異検出も可能であった。
次に、チアゾールオレンジとは異なる波長を持つチアゾールブルー(630/650nm)を、同じくSmartAmp法に導入し、タイピングが可能であることを確認した。計画書では次年度に該当するが、この二色の蛍光を用いて、ワルファリン代謝に関連する遺伝子であるVKORC1において、1チューブ内で2反応を同時に行うマルチプレックスシステムを開発し、リアルタイムPCRを用いて、それぞれの増幅(蛍光)を検出することができた。これらの成果はNucleic Acids Researchに投稿中である
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