研究課題
放射線や環境変異原によって生じるDNA損傷の多くはDNA複製を阻害する。DNA複製の停止は細胞にとって致死的であるが、この阻害されたDNA複製を再開する分子機構、複製後修復(PRR)が働くことにより細胞死は回避される。PRRは二つの経路、損傷乗り越えDNA合成経路とTemplate switch経路からなる。本研究の目的は、PRRの二つの経路の生化学反応を試験管内で再構成し、その分子機構を解析することにある。損傷乗り越えDNA合成(TLS)経路の解析TLS経路では、停止したプライマー末端からの損傷塩基を鋳型としたDNA合成により、DNA複製を再開する。この反応はRAD6-RAD18によるPCNAのモノユビキチン化により制御されると考えられる。本研究では、PAD6-PAD18によるPCNAのモノユビキチン化反応、2)複製型のDNAポリメラーゼ(POIδ)が、損傷部位でTLSポリメラーゼ(Polη)と交換する反応、3)TLSポリメラーゼ(Poι、Po1κ、REV1)がこの反応系に及ぼす影響、4)複製型めDNAポリメラーゼとREV1の交換反応を解析した。本年度は特に、PAD6-PAD18の構造と機能を解析し、PCNAのモノユビキチン化反応の分子基盤を明らかにした。Template switch(TS)経路の解析TS経路では、停止したプライマー末端が新生娘鎖とアニーリングし、損傷のない鋳型を使ったDNA合成を行うことによりDNA合成を再開する。この反応は、SHPRHまたはHLTFタンパク質によるPCNAのポリユビキチン化により制御されると考えられる。本研究では、PCNAのポリユビキチン化に始まる一連の生化学的反応を再構成し、TS経路の生化学的実体の解析を目指している。これまでに、1)HLTFの精製法を確立し、2)HLTFが実際にPCNAをポリユビキチン化する活性を持つことを証明し、3)その分子機構を解析した。本年度は、HLTF詳細な酵素学的解析を推進した。
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