研究課題
本研究は、第3の生物と言われるアーキア(古細菌)を用いて、その生命現象の基本原理を追求すべく、DNA複製、修復の分子機構を生化学的、遺伝学的に解析していこうとするものである。用いているアーキアは生命の起源により近いと考えられる超好熱性のものであり、代表者の石野は、Pyrococus furiosusを用いて、この研究領域の世界先端を開拓してきた。また、分担者の跡見は、同属のThermococcus kodakaraensisを用いて遺伝子破壊実験系を確立し、世界の注目を集めている。本研究においては、両者が協力して、世界に先駆けて超好熱性アーキアのDNA複製および、それと協調した修復機構の分子機構の全容解明に迫りたいと考えている。初年度は、これまでに進めて来たDNA複製開始、伸長課程に関わる蛋白質因子の機能・構造解析を進めると共に、遺伝子破壊実験系、遺伝子導入実験系は確立したものの、そのDNAトランスアクションについては未だ殆ど未知であるThermococcus kodakaraensisを用いて、関連蛋白質の中から重要なものを順次解析していく戦略を取った。複製開始と伸長の両過程で重要なMcm蛋白質、それから伸長過程で様々な蛋白質と相互作用しながら複製フォークの中心的な役割を果たすPCNAについて解析を始めた。大変興味深いことに、T.kodakaraensisにはMcmホモログが3種類、PCNAホモログが2種類存在するが、これまでに機能解析はなされておらず、その役割についても全く分かっていなかった。本研究では、まずこれらの遺伝子をクローニングし、大腸菌を用いて発現系を構築して、蛋白質の調製を行った。その結果、上記の5種類の蛋白質を高純度で精製する手順を確立した。また、それぞれの遺伝子について破壊株の作成を試み、そのいくつかはすでに取得した。生存に必須であるために破壊株が得られないものもあった。本研究計画におけるこれらの基礎実験が本年度に終了した。
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