研究課題
本年度は以下の研究を行った。スッポン(Pelodiscus sinennsis)のメスを解剖し、卵管の組織を摘出した。卵管組織からIsogehを使用して、トータルRNAを抽出した。このトータルRNAを鋳型にして、complementary DNA(cDNA)を合成した。スッポンの卵殻に基質として含まれるタンパク質Pelovaterinは卵管から分泌されている可能性が高いため、この卵管組織由来のcDNAを使って、PelovaterinのmRNAを増幅することを試みた。PCR法によってPelovaterin遺伝子を増幅するため、Pelovaterinのアミノ酸配列をもとにセンスプライマーを2種、アンチセンスプライマーを1種作成した。これらのプライマーを使用してPCR法を行った。アニーリング温度などの条件を変えて、複数回PCR法を行った。増幅されたPCR産物をTベクターに組み込み、大腸菌によってクローニングしたうえで、PCR産物の塩基配列を明らかにしたが、求める配列、つまりPelovaterinをコードしているcDNAの配列を同定することはできなかった。理由としては、作成したcDNAの純度が低い可能性が考えられる。ポジティブコントロールとしてEF-1α遺伝子を増幅した場合、増幅はされるが、ほかのタンパク質も増幅されていた。そこで、スッポンのゲノムからPelovaterinを同定することを試みている。現在、ゲノムを抽出し、ポジティブコントロールでその状態を調べている。
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