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本研究の初年度においては主に軟体動物(マダコ)由来のヘモシアニンを用いて、サブユニットや最小活性ユニットの単離・精製および活性化について検討を行った。そこで本年度は、遺伝子工学の手法を駆使して、活性中心を覆っているペプチド鎖を除去したヘモシアニン(人工チロシナーゼ)を新たに調製するとともに、節足動物(ワタリガニ)由来のヘモシアニンにも研究対象を広げた。
各ヘモシアニンについては、ヒドロキシルアミンなどのマイルドな還元剤と嫌気性条件下で作用させ、Deoxy体を調製し、その構造や安定性について検討すると共に、分子状酸素との反応を行い、ペルオキソ二核銅(II)活性種を有するOxy体を調製した。さらに得られたOxy体の安定性や分光学的特性(紫外可視吸収スペクトル、ESRスペクトル、共鳴ラマンスペクトルなど)などについて詳細に検討し、二核銅活性中心における酸素分子の活性化機構について考察を加えた。また、ヘモシアニンの電気化学的挙動についても検討を加え、ビス(μ-オキソ)二核銅(III)活性種の生成の可能性について検討した。しかし、これについては期待した結果は、まだ得られていない。
さらに各ヘモシアニンとフェノールなどの各種有機基質との反応を調査し、オキシヘモシアニンの酸化機能を評価した。酸化反応が効率良く進行したフェノールについては、一連の関連基質を用いてOxy-ヘモシアニンのペルオキソ活性種との反応を紫外可視吸収スペクトルなどの分光学的手段を用いて追跡し、基質置換基の電子的効果や立体効果、速度論的同位体効果、同位体標識などについて検討し、反応機構について考察を加えた。
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