バンド3の三次元結晶構造解析と陰イオン透過分子機序の解明

2010 年度 研究成果報告書

• 研究課題/領域番号: 20370035
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 構造生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 小林 拓也 京都大学, 医学研究科, 講師 (20311730)
• 研究分担者: 村田 武士 千葉大学, 理学研究科, 特任准教授 (80415322)
• 連携研究者: 岩田 想 京都大学, 医学研究科, 教授 (60452330)
• 研究期間 (年度): 2008 – 2010
• キーワード: X線結晶解析

研究概要

2000年以降、濱崎らはヒト赤血球よりバンド3の膜貫通ドメインを単一に精製する方法を確立し、2005年から小林らとバンド3の結晶構造解析に向けて共同研究がスタートした。2008～2010年の基盤研究(B)(代表者 小林)では、バンド3に対する構造認識抗体を作製し、アニオン輸送の阻害剤を噛ませて外向き型に固定化したバンド3/抗体(Fab)複合体を結晶化した。その結果、マイクロフォーカスビームやピクセル検出器を用いた低振動角測定/ラインスキャンをはじめとしたビームラインの特長を生かして3.4Åを超える分解能でデータを収集することに成功した。現在、分解能3.4Åの電子密度図に対しモデル構築と精密化を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of the Pichia pastoris expression system for the production of GPCRs for structural analysis. (2011)
  • 著者名/発表者名: H.Asada, T.Uemura, T.Yurugi-Kobayashi, M.Shiroishi, T.Shimamura, H.Tsujimoto, K.Ito, T.Sugawara, T.Nakane, N.Nomura, T.Murata, T.Haga, S.Iwata, T.Kobayashi.
  • 雑誌名: Microbial Cell Factories (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cloning, expression and purification of the anion exchanger 1 homologue from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. (2011)
  • 著者名/発表者名: N.Tokuda, K.Igarashi, T.Shimamura, T.Yurugi-Kobayashi, M.Shiroishi, K.Ito, T.Sugawara, H.Asada, T.Murata, N.Nomura, S.Iwata, T.Kobayashi.
  • 雑誌名: Protein Expr. Purif. (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cysteine-to-serine shuffling using a yeast expression system improves protein secretion : case of a nonglycosylated mutant of miracullin, a taste-modifying protein. (2011)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, T.Sugawara, A.Koizumi, K.Nakajima, A.Shimizu-Ibuka, M.Shiroishi, H.Asada, T.Yurugi-Kobayashi, T.Shimamura, T.Asada, T.Misaka, S.Iwata, T.Kobayashi, K.Abe.
  • 雑誌名: Biotech. Lett. 33 ページ: 103-107
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of Glucansucrase form the dental caries pathogen Streptococcus mutans. (2011)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, S.Ito, T.Shimamura, S.Weyand, Y.Kawarasaki, T.Misaka, K.Abe, T.Kobayashi, A.D.Cameron, S.Iwata.
  • 雑誌名: J.Mol.Biol. (in press)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of a Glucansucrase from the dental caries pathogen Streptococcus mutans. (2010)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, S.Ito, T.Shimamura, Y.Kawarasaki, T.Kobayashi, S.Iwata.
  • 雑誌名: Acta. Crystallogr. Sect.F 66 ページ: 1086-1088
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bulky high-mannose-type N-glycan blocks the taste-modifying activity of miraculin. Biochim. (2010)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, T.Sugawara, A.Koizumi, K.I.Nakajima, A.Shimizu-Ibuka, M.Shiroishi, H.Asada, T.Yurugi-Kobayashi, T.Shimamura, T.Asakura, K.Masuda, M.Ishiguro, T.Misaka, S.Iwata, T.Kobayashi, K.Abe.
  • 雑誌名: Biophys. Acta. 1800 ページ: 986-992
  • 査読あり
• [雑誌論文] Characterization of the β-D-glucopyranoside binding site of the human bitter taste receptor hTAS2R16. (2010)
  • 著者名/発表者名: T.Sakurai, T.Misaka, M.Ishiguro, K.Masuda, T.Sugawara, K.Ito, T.Kobayashi, S.Matsuo, Y.Ishimaru, T.Asakukra, K.Abe.
  • 雑誌名: J.Biol. Chem. 285 ページ: 28373-28378
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluorescence-based optimization of human bitter taste receptor expression in Saccharomyces cerevisiae. (2009)
  • 著者名/発表者名: T.Sugawara, K.Ito, M.Shiroishi, N.Tokuda, H.Asada, T.Yurugi-Kobayashi, T.Shimamura, T.Misaka, N.Nomura, T.Murata, K.Abe, S.Iwata, T.Kobayashi.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res.Commun. 382 ページ: 704-710
  • 査読あり
• [雑誌論文] Comparison of functional non-glycosylated GPCRs expression in Pichia pastoris. (2009)
  • 著者名/発表者名: T.Yurugi-Kobayashi, H.Asada, M.Shiroishi, T.Shimamura, S.Funamoto, N.Katsuta, K.Ito, T.Sugawara, N.Tokuda, H.Tsujimoto, T.Murata, N.Nomura, K.Haga, T.Haga, S.Iwata, T.Kobayashi.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res.Commun. 380 ページ: 271-276
  • 査読あり
• [雑誌論文] Advanced method for high-throughput expression of mutated eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. (2008)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, T.Sugawara, M.Shiroishi, N.Tokuda, A.Kurokawa, T.Misaka, H.Makyio, T.Yurugi-Kobayashi, T.Shimamura, N.Nomura, T.Murata, K.Abe, S.Iwata, T.Kobayashi.
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res.Commun. 371 ページ: 841-845
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interaction and stoichiometry of the peripheral stalk subunits NtpE and NtpF and the N-terminal hydrophilic domain of NtpI of Enterococcus hirae V-ATPase. (2008)
  • 著者名/発表者名: M.Yamamoto, S.Unzai, S.Saijo, K.Ito, K.Mizutani, C.Suno-Ikeda, Y.Yabuki-Miyata, T.Terada, M.Toyama, M.Shirouzu, T.Kobayashi, Y.Kakinuma, I.Yamato, S.Yokoyama, S.Iwata, T.Murata.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 283 ページ: 19422-19431
  • 査読あり
• [学会発表] Gタンパク共役受容体(GPCR)の三次元結晶構造解析への試み (2011)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第84回日本薬理学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2011-03-24
• [学会発表] A GFP-based platform for rapid construction and evaluation of highly expressed and stable GPCR variants in Saccharomyces cerevisiae (2010)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: GPCR workshop
  • 発表場所: Hawaii
  • 年月日: 2010-12-10
• [学会発表] G蛋白質共役受容体(GPCR)の構造解析に向けて「生産から結晶構造解析までの技術開発」 (2009)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第82回日本生化学会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2009-10-22
• [学会発表] Towards Structure Determination of Human Membrane Receptors and Production of Functional GPCRs in Pichi pastoris (2008)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: 第5回GPCR研究会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2008-05-09
• [学会発表] Towards Structure Determination of Human Membrane Receptors -from Prostanoid receptor studies-、播磨放射光施設 (2008)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 学会等名: GPCRシンポジウム
  • 年月日: 2008-02-26
• [図書] Gタンパク質共役受容体(GPCR)の三次元結晶構造解析への試み、23-29 (2011)
  • 著者名/発表者名: 小林拓也
  • 出版者: バイオインダストリー(シーエムシー出版)
• [図書] Advanced technologies to determine the 3D structure of taste receptors. The Sense of Taste. (2011)
  • 著者名/発表者名: K.Ito, T.Misaka, K.Abe, T.Kobayashi
  • 出版者: Nova Science Publishers, Inc.(印刷中)
• [備考] ホームページ等
  • URL: http://www.med.kyoto-u.ac.jp/J/grad_school/introduction/1502/
• [産業財産権] 膜蛋白質の立体構造を認識するモノクローナル抗体のスクリーニング方法 (2010)
  • 発明者名: 小林拓也、岩田想, ら
  • 権利者名: 科学技術振興機構JST
  • 産業財産権番号: PCT国際出願,PCT/JP2010/57631
  • 出願年月日: 20100400