| 研究概要 |
ジストログリカンの糖鎖修飾異常による筋ジストロフィーの原因遺伝子産物の構造機能解析を行った。POMGnT1については、昆虫培養細胞の発現系では発現はするがごく少量であるか沈殿画分であり、結晶化サンプルとしては適さなかった。そこで、大腸菌の発現系を用いたところ、沈殿としてではあるが一定量の発現が観察された。これを用いて結晶化スクリーニングを行ったが現在のところ結晶を得るには至っていない。小麦胚芽を用いた無細胞発現系では可溶画分で発現が観察され、今後のスケールアップにより結晶化実験を行える目処をつけることができた。
PomT1,T2については単独での発現を試みたが結晶化に適したサンプルを得ることができず、昆虫培養細胞を用いた共発現のためのコンストラクトの構築を行った。fukutin, FKRPについては大腸菌の発現系で得た大量の沈殿発現産物を変性再生して可溶化し、結晶化スクリーニングを行った。結晶は得られていないが、変性再生による精製法を見出すことができたので、より広範囲の結晶化条件の探索を行うことで立体構造解析に向けた結晶の作成に路を開くことができた。
POMT1, T2の活性発現における複合体形成能の影響をそれぞれの変異体を用いて調べたところ、酵母ScPmt1とヒトPOMT1のlooplが酵素活性に必要であるが、複合体形成のメカニズムはヒトと酵母で異なっており、そうした相違が基質特異性などに影響を及ぼしている可能性が示唆された。一方、ゼブラフィッシュzPOMT1とzPOMT2については哺乳類のPOMTと同様で、複合体形成による活性発現機構が種を越えて保存されていた。zPOHT1ノックダウン体では心膜の浮腫や尾部の形成異常、zPOMT2ノックダウン体では心膜の浮腫や尾部の形成異常、眼の色素異常が見られ、いずれにおいてもα-ジストログリカンのO-Man型糖鎖の著しい減少が確認された。
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