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細菌べん毛は、細胞膜を透過するイオンの流れをエネルギーとして回転する生体超分子モーターであり、約25種類以上の異なった蛋白質から構成される。現状では、その回転の機構はほとんどわかっていない。本申請研究では、イオン流のモーター回転力への変換を担う細胞膜中のナトリウムチャネルPomABの三次元構造を、低温電子顕微鏡法、X線結晶回折法により高分解能で解析し、回転機構の解明を目指している。本年度は、高圧連続式ホモジナイザー、遠心機、培養機、オートクレーブ等を導入し、効率的にPomAB複合体の精製ができるようになった。すでに、単分散した試料の負染色電子顕微鏡像からの単粒子解析法による三次元構造解析は完了し、現在論文審査の段階にある。より生理的な状態の解析に向け、低温電子顕微鏡の撮影条件の検討を行った。まず、単離精製した試料を液体窒素温度で電子顕微鏡観察したところ、ほとんどの試料がカーボン膜に吸着し氷中に包埋されにくいことが分かった。一方、PomABの機能単位は分子量が20万以下であり非染色の試料の観察は難しいと予想されていたが、電子分光によりコントラストよく解像できることが分かった。今後、試料濃度、界面活性剤濃度等の条件を変え、氷包埋条件を検討、単粒子解析法により10Å程度の分解能で三次元構造を解析する。また、ナトリウムイオン濃度を変化させ、モーターのトルク発生に関係する構造変化の可視化を行う。同時にX線結晶回折法に向け、結晶化を進めていく。
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