| 研究課題/領域番号 |
20380053
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部・生物工学科, 教授 (00222589)
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| 研究分担者 |
米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 准教授 (50285160)
冨宿 賢一 富山県立大学, 工学部, 助教 (70392090)
山根 隆 名古屋大学, 工学研究科, 教授
由里元 博也 京都大学, 大学院・農学研究科応用生命科学専攻 (00283648)
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| 研究期間 (年度) |
2009 – 2011
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| キーワード | 酵素 / 応用微生物 / 植物 / 遺伝子 / 有機工業化学 |
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| 研究概要 |
(1)植物酵素ヒドロキシニトリルリアーゼ(HNL)の開発と光学活性シアノヒドリンの合成に関する研究:多種類のHNLのライブラリーを構築する目的で、我々が発見した数種類のHNL遺伝子の異種宿主での発現を検討した。P.mume(梅)については、cDNAクローニング、一次構造の解明およびPichia pastorisにおける活性発現に成功した。Baliospermum montanumについてはcDNAクローニングしN末端にHis-Tagの付加、およびC末端の短縮化によって大腸菌で可溶性に発現できた。B.montanum由来HNLの酵素化学的諸性質、各種の芳香族、脂肪族の光学活性シアノヒドリンの不斉合成について明らかにした。Manihot esculenta(キャッサバ)、Hevea brasiliensis(ゴム)由来(S)-HNLを、大腸菌、酵母、原生動物Leishmania tarentolae (LEXSYシステム)、無細胞タンパク質合成システム、大腸菌由来in vitroタンパク質合成ピュアシステム等において発現を検討した。assiflora edulis(パッションフルーツ)からのHNLを精製し、酵素化学的諸性質を初めて明らかにした。有機溶媒二層系により(R)-マンデロニトリルを合成した。Arabidopsis thaliana由来(R)-HNLは、遺伝子クローニングし、大腸菌で発現し、Henry反応に応用した。E.japonica由来(R)-HNLの酵素化学的諸性質を明らかにすると共に、有機溶媒と水の二相系での合成反応を行い、各種芳香族や脂肪族のS光学活性シアノヒドリン合成法を完成した。
(2)可溶性HNLの発現メカニズムの解明:M.esculenta 由来HNL遺伝子の大腸菌における種々の発現条件を検討した。His103Leuの一点の変異や、3箇所のLys残基をProに変異させると、封入体の蛋白質がほぼ可溶性になる大量発現の現象を見出しているので、可溶性な活性蛋白質の酵素化学的諸性質と発現メカニズムの解明、可溶性となる変異の一般性についての検討を行った。P
(3)アミノ酸アミドやアミノニトリルのダイミックな光学分割:アミノ酸アミドラセマーゼの構造解析と進化分子工学については、名古屋大学工学部の山根隆教授らと共にACLラセマーゼの構造の解明に成功しており、基質特異性を左右する部位に特化して変異を行い、アミノ酸アミドに対する反応速度が向上した変異型酵素を得た。さらに、変異型酵素の速度論的検討を行った。土壌からのスクリーニングにより新しいアミノ酸アミドラセマーゼを得た。
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