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研究代表者らが発見したジテルペン合成酵素PaFSは、N末端側にジテルペン環化酵素ドメイン(GGDP環化反応)、C末端側にプレニル転移酵素ドメイン(GGDP合成反応)を有する新規なキメラ型高機能酵素であり、その遺伝子ホモログは菌類ゲノムに広く存在することを示していた。そこで、一般的に二次代謝物を生産しないと考えられている麹菌Aspergillus oryzae菌体よりその遺伝子ホモログ2種類AoDS1、AoDS2をcDNAクローニングすることに成功した。しかしながら、ともにC末端側のプレニル転移酵素ドメインをコードする領域に変異がみられ(AoDS1は途中に停止コドン出現、AoDS2は活性中心のアスパラギン酸がアラニンに置換)、プレニル転移酵素活性が消失したと考えられた。タンパク質工学的手法を用いてこれら酵素を高機能酵素として蘇生させることを試みている。またぐ高等植物細胞において、GGDP合成活性が高い色素体、あるいはGGDP合成活性が低い細胞質でPaFSを発現させ、目的環化産物の蓄積量を比較・検討するために、シロイヌナズナ形質転換用プラスミドを構築した。色素体移行のためのトランジットペプチド様配列をN末側に、さらに細胞内局在解析用マーカーGFPをC末に付加してもPaFSの活性は消失しないことを大腸菌発現組換え酵素を用いて確認した。形質転換シロイヌナズナを作成し、目的環化物生産について検討する予定である。また、既存のジテルペン環化酵素であるGibberella fujikuroi由来entカウレン合成酵素のN末端、あるいはC末端にGGDP合成酵素を連結した人工酵素を調製したが、酵素活性が消失した。接続用リンカーについて検討する予定である。
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