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研究代表者らが発見したジテルペン合成酵素PaFSは、N末端側にジテルペン環化酵素ドメイン(GGDP環化反応)、C末端側にプレニル転移酵素ドメイン(GGDP合成反応)を有する新規なキメラ型高機能酵素であり、その遺伝子ホモログは菌類ゲノムに広く存在することを示していた。昨年度、一般的に二次代謝物を生産しないと考えられている麹菌Aspergillus oryzae菌体よりcDNAクローニングしたPaFSホモログAoDS1は、途中に停止コドンが出現し、プレニル転移酵素活性が消失したと考えられた。そこで本年度は、タンパク質工学的手法を用いて、停止コドンをチロシンコードに戻したところ、プレニル転移酵素活性は復活し、この酵素を高機能酵素として蘇生させることに成功した。さらに今年度は、イネの重要病害菌であるいもち病菌よりPaFSホモログ4種のcDNAクローニングに成功したが、環化酵素活性を検出できたのはMgDS3のみであった。この遺伝子も3'側に欠失がみられ、プレニル転移酵素活性は消失していたので、AoDS1と同様に多機能酵素として復活させる予定である。また、高等植物細胞において、GGDP合成活性が高い色素体、あるいはGGDP合成活性が低い細胞質でPaFSを発現させ、目的環化産物の蓄積量を比較・検討するために、昨年度構築したシロイヌナズナ形質転換用プラスミドを利用して、組換え植物を作成した。選抜マーカーによるスクリーニングにより、目的組換え体を得ることに成功した。これらを用いて酵素生成物であるフシコッカジエンの植物細胞内での蓄積などを検討していく予定である。
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