プロテアーゼによるENaC細胞内局在制御メカニズムの解明

2009 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20390060
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 丸中 良典 京都府立医科大学, 医学研究科, 教授 (00127036)
• 研究分担者: 新里 直美 京都府立医科大学, 医学研究科, 准教授 (00237645) ; 宮崎 裕明 京都府立医科大学, 医学研究科, 助教 (30360027) ; 中島 謙一 京都府立医科大学, 医学研究科, 助教 (40398392)
• キーワード: ENaC / アルデステン / 皮質集合管 / プロテアーゼ阻害剤 / 浸透圧 / トラッフィッキング / 高血圧 / ナトリウム輸送

研究概要

1) プロテアーゼ構造修飾とリサイクル効率
HA-ENaC発現細胞(野生型)とmyc-ENaC発現細胞(変異導入型)においてプロテアーゼ処理(実験系1)およびプロテアーゼ遺伝子を共発現(実験系2)させた後、エンドサイトーシス/リサイクルが可能な条件(37℃)で標識(1次)抗体によりENaCを特異的にラベルして一定時間後に氷冷して反応を止め、細胞膜表面に存在するENaCだけから標識抗体をはずした。このあと、細胞を37℃に戻し、一定時間後に細胞膜表面を標識(1次)抗体に結合する2次抗体を反応させ、リサイクルされてきたENaCを2次抗体標識マーカーにより定量化した。この結果から、プロテアーゼによる構造修飾がリサイクル効率を上昇させることが示唆された。
2) ユビキチン化とリサイクル効率
1. ユビキチン化とリサイクル効率の関連性について明らかにするために、HA-ENaC(野生型)とmyc-ENaC(変異導入型)遺伝子それぞれにNedd4-2との結合に重要なPY motifに変異導入してNedd4-2と結合できない安定発現系を構築した。
2. 上記(1)で構築したHA-ENaC(野生型)とmyc-ENaC(変異導入型)のそれぞれでPY motifに変異導入した系としない系を用いて、上記の1)プロテアーゼ構造修飾とリサイクル効率と同じ方法で細胞内のendosomeなどに取り込まれたENaCのみを標識抗体でラベルして、その後のリサイクル効率を2次抗体を反応させることで定量化して、PY motifへの変異導入がリサイクルにどのような影響を及ぼしたかを検証した。この実験結果より、ユビキチン化によりリサイクル効率が低下するということが、示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] Chloride ion modulates cell proliferation of human androgen-independent prostatic cancer cell. (2010)
  • 著者名/発表者名: Hiraoka K, Miyazaki H, Niisato N, Iwasaki Y, Kawauchi A, Miki T, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Cell Physiol Biochem. 25(4-5) ページ: 379-388
  • 査読あり
• [雑誌論文] Intracellular chloride regulates cell proliferation through the activation of stress-activated protein kinases in MKN28 human gastric cancer cells. (2010)
  • 著者名/発表者名: Ohsawa R, Miyazaki H, Niisato N, Shiozaki A, Iwasaki Y, Otsuji E, Marunaka Y.
  • 雑誌名: J Cell Physiol. 223(3) ページ: 764-770
  • 査読あり
• [雑誌論文] NaCl flux between apical and basolateral side recruits claudin-1 to tight junction strands and regulates paracellular transport. (2010)
  • 著者名/発表者名: Tokuda S, Miyazaki H, Nakajima K, Yamada T, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 393(3) ページ: 390-396
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hydrostatic pressure regulates tight junctions, actin cytoskeleton and transcellular iontransport. (2009)
  • 著者名/発表者名: Tokuda S, Miyazaki H, Nakajima K, Yamada T, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 390(4) ページ: 1315-1321
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two cases of complex sleep apnea syndrome. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Arimoto T, Koyama Y, Masui A, Tamiya N, Hosogi S, Hiramatu A, Nakanishi M, Kohno Y, Ueda M, Iwasaki Y, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi 47(9) ページ: 793-797
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phase II trial of weekly gemcitabine and split-dose cisplatin for advanced non-small-cell lung cancer. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hiramatsu A, Iwasaki Y, Koyama Y, Tamiya N, Hosogi S, Nakanishi M, Kohno Y, Ueda M, Arimoto T, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol 39(12) ページ: 779-783
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effects of extracellular chloride ion on epithelial sodium channel (ENaC) in arginine vasotocin (AVT)-stimulated renal epithelial cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Niisato N, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Biomed Res. 30(3) ページ: 193-198
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulation of paracellular Na+ and Cl(-) conductances by hydrostatic pressure (2009)
  • 著者名/発表者名: Tokuda S, Niisato N, Nagai T, Taruno A, Nakajima K, Miyazaki H, Yamada T, Hosogi S, Ohta M, Nishio K, Iwasaki Y, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Cell Biol Int. 33(9) ページ: 949-956
  • 査読あり
• [雑誌論文] Blockers of K+/Cl- transporter/channels diminish proliferation of osteoblastic cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Maki M, Miyazaki H, Niisato N, Morihara T, Marunaka Y, Kubo T.
  • 雑誌名: Biomed Res. 30(2) ページ: 137-140
  • 査読あり
• [雑誌論文] Action of N-acylated ambroxol derivatives on secretion of chloride ions in human airway epithelia. (2009)
  • 著者名/発表者名: Yamada T, Takemura Y, Niisato N, Mitsuyama E, Iwasaki Y, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 380(3) ページ: 586-590
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quercetin stimulates Na+/K+/2Cl-cotransport via PTK-dependent mechanisms in human airway epithelium. (2009)
  • 著者名/発表者名: Asano J, Niisato N, Nakajima K, Miyazaki H, Yasuda M, Iwasaki Y, Hama T, Dejima K, Hisa Y, Marunaka Y.
  • 雑誌名: Am J Respir Cell Mol Biol. 41(6) ページ: 688-695
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atypical antipsychotics suppress production of proinflammatory cytokines and up-regulate interleukin-10 in lipopolysaccharide-treated mice. (2009)
  • 著者名/発表者名: Sugino H, Futamura T, Mitsumoto Y, Maeda K., Marunaka Y.
  • 雑誌名: Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 33(2) ページ: 303-307
  • 査読あり
• [学会発表] Regulation of Cell Growth by Chloride Ion via MAPK-dependent Pathways. (2010)
  • 著者名/発表者名: Marunaka Y.
  • 学会等名: BIT's 3rd Annual World Congress of PepCon-2010
  • 発表場所: China
  • 年月日: 20100321-20100323
• [学会発表] 神経突起伸長におけるクロライドイオン輸送体NKCC1の役割-フラボノイドによる神経再生の試み- (2009)
  • 著者名/発表者名: 中島謙一、新里直美、丸中良典
  • 学会等名: 生理研研究会「上皮組織における細胞外環境感受機構」
  • 発表場所: 岡崎
  • 年月日: 20091109-20091110
• [学会発表] アルドステロンによるNa+再吸収亢進はp38を介する (2009)
  • 著者名/発表者名: 太田麻利子、新里直美、丸中良典
  • 学会等名: 生理研研究会「上皮組織における細胞外環境感受機構」
  • 発表場所: 岡崎
  • 年月日: 20091109-20091110
• [学会発表] Dephosphorylation of ERK by MKP-1 stimulates beta-and gamma-ENaC mRNA expression of renal A6 cells in hypotonic stress. (2009)
  • 著者名/発表者名: Niisato N, Ohta M, Marunaka Y.
  • 学会等名: 40th NIPS International symposium-International Joint symposium : PAT-CVR 2009
  • 発表場所: Okazaki
  • 年月日: 20090803-20090806
• [学会発表] MKP1-DEPENDENT ERK KEPHOSPHORYLATION SYIMULATES Na^+ REABSORPTION THROUGH BETA-AND GAMMA-ENaC EXPRESSION IN HYPOTONIC STRESS. (2009)
  • 著者名/発表者名: Niisato N, Ohta M, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] MODIFICATION OF OSMOREGULATED ENaC TRAFFICKING BY ALDOSTERONE AND PROTEASE INHIBITOR. (2009)
  • 著者名/発表者名: Nagai T, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] SODIUM HYDROGEN EXCHANGER ISOFORM1 (NHE-1)-DEPENDENT PROLIFERATION OF GASTRIC CANCER CELLS. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hosogi S, Takemura Y, Miyazaki H, Niisato N, Iwasaki Y, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] INTRACELLULAR CHLORIDE REGULATES CELL PROLIFERATION OF ANDROGEN-INDEPENDENT PROSTATE CANCER PC3 CELL. (2009)
  • 著者名/発表者名: Hiraoka K, Miyazaki H, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] INTRACELLULAR CHLORIDE-DEPENDENT MECHANISM OF ACTIVATION OF STRESS-ACTIVATED PROTEIN KINASED IN HUMAN GASTRIC CANCER MKN28 CELLS. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohsawa R, Miyazaki H, Otsuji E, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] INTRACELLULAR CHLORIDE REGULATES THE G1/S CELL CYCLE CHECKPOINT IN HUMAN GASTRIC CANCER MKN28 CELLS. (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyazaki H, Ohsawa R, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] THE ROLE OF CHLORIDE ION IN DYNAMICS OF MICROTUBULE. (2009)
  • 著者名/発表者名: Nakajima K, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: 36TH INTERNATIONAL CONGRESS OF PHYSIOLOGICAL SCIENCES.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090727-20090801
• [学会発表] ERK dephosphorylation by MKP-1 stimulates Na^+ reabsorption through beta-and gamma-ENaC expression in hypotonic stress. (2009)
  • 著者名/発表者名: Niisato N, Ohta M, Marunaka Y.
  • 学会等名: Satellite Symposium of International Union of Physiological Sciences-2009, Epithelial Ion Transport in Health and Disease.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090723-20090725
• [学会発表] Intracellular chloride regulates the G1/S cell cycle checkpoint in human gastric cancer MKN28 cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Miyazaki H, Ohsawa R, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: Satellite Symposium of International Union of Physiological Sciences-2009, Epithelial Ion Transport in Health and Disease.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090723-20090725
• [学会発表] The role of chlorideion in dynamics of microtubule. (2009)
  • 著者名/発表者名: Nakajima K, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: Satellite Symposium of International Union of Physiological Sciences-2009, Epithelial Ion Transport in Health and Disease.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090723-20090725
• [学会発表] p38 MAPK regulate ENaC-mediated Na^+ transporty aldosterone in renal epithelial A6 cells. (2009)
  • 著者名/発表者名: Ohta M, Niisato N, Marunaka Y.
  • 学会等名: Satellite Symposium of International Union of Physiological Sciences-2009, Epithelial Ion Transport in Health and Disease.
  • 発表場所: Kyoto
  • 年月日: 20090723-20090725
• [学会発表] 低浸透圧刺激は、MKP1の発現制御によりENaCを介するNa+再吸収を亢進する (2009)
  • 著者名/発表者名: 新里直美, 西尾恭介, 丸中良典
  • 学会等名: 第52回日本腎臓学会学術総会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20090603-20090605
• [学会発表] フラボノイドによる神経再生の試み (2009)
  • 著者名/発表者名: 丸中良典, 新里直美
  • 学会等名: 第12回研究報告会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20090601-20090602
• [学会発表] ヒト気道上皮細胞におけるクロライドイオン分泌のフラボノイドによる制御機構;アルドステロンおよび浸透圧の上皮型ナトリウムチャネル細胞内局在修飾作用 (2009)
  • 著者名/発表者名: 丸中良典, 新里直美
  • 学会等名: 日本膜学会第31年会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20090521-20090522
• [学会発表] クロライドイオン輸送体を分子標的とするアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞増殖制御の試み (2009)
  • 著者名/発表者名: 平岡健児, 沖原宏治, 浮村理, 高羽夏樹, 水谷陽一, 河内明宏, 宮崎裕明, 新里直美, 丸中良典, 三木恒治
  • 学会等名: 第97回日本泌尿器科学会総会
  • 発表場所: 岡山
  • 年月日: 20090416-20090419
• [学会発表] プロテアーゼによるENaC寿命決定メカニズム (2009)
  • 著者名/発表者名: 丸中良典, 新里直美, 宮崎裕明, 中島謙一, 山田敏樹
  • 学会等名: 第21回平成20年度助成研究発表会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2009-07-21
• [学会発表] ケルセチンはヒト気道上皮においてPTKが関与する経路を介しNa^+/K^+/2CI cotransportを活性化する (2009)
  • 著者名/発表者名: 安田誠, 浅野純志, 新里直美, 宮崎裕明, 中島謙一, 岩崎吉伸, 浜雄光, 出島健司, 久育男, 丸中良典
  • 学会等名: 第3回iPUC-II (Integrtated Pulonary Circulation Research-II)
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2009-06-27