| 研究課題/領域番号 |
20390356
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
猪飼 伊和夫 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60263084)
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| 研究分担者 |
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449)
安近 健太郎 京都大学, 医学研究科, 助教 (00378895)
石井 隆道 京都大学, 再生医科学研究所, 研究員 (70456789)
加茂 直子 京都大学, 医学研究科, 医員 (50452355)
波多野 悦朗 京都大学, 医学研究科, 助教 (80359801)
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| キーワード | ヒトES細胞 / 分化誘導 / 肝細胞 / 細胞移植 |
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| 研究概要 |
1.ヒトES細胞由来未分化内胚葉細胞の安定的分化誘導法の確立。
昨年度までに作製した、AFPプロモーター下にGFPおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する遺伝子改変ヒトES細胞を用いて種々の培養条件下で分化誘導を施行し、フローサイトメーターを用いたGFP発現細胞の出現頻度の検証に基づき、ヒトES細胞由来AFP産生細胞の至適分化誘導条件を決定した。各分化誘導条件により出現する細胞に対してRT-PCRにより各種未分化および分化マーカーの発現を検証すると共に多重免疫染色により個々の細胞に対する分化状態を同定した。
2.ヒトES細胞由来初期肝細胞の分離。
上記を踏まえて決定した分化誘導法により分化させたヒトES細胞由来AFP産生細胞を、GFP発現を指標に蛍光励起セルソーターを用いて分離することを試みたが、viabilityが著しく低下したため薬剤選別を利用して分離した。分離細胞に対してRT-PCR,多重免疫染色を施行し、ヒトES細胞由来AFP産生細胞の単離を確認した。
ヒトES細胞由来初期肝細胞の成熟化。
1)非共培養系成熟化法
単離したヒトES細胞由来AFP産生細胞を種々の増殖因子添加培地により培養すると共に、コラーゲンIおよびマトリゲルコーティング培養皿で培養した。
2)共培養系成熟化法
マウスES細胞由来初期肝細胞に対する分化誘導活性を既に確認済みであるマウス胎仔肝由来Thy1陽性間葉系細胞を分離し、単離したヒトES細胞由来AFP産生細胞と共培養した。また、再生医科学研究所において樹立された3株のマウス胎仔肝由来Thy1陽性間葉系細胞株とも共培養し、各種肝細胞分化マーカーに対するRT-PCR,多重免疫染色を行うと共に、アンモニア除去能などの機能解析を行いヒトES細胞由来AFP産生細胞の成熟化を検証した。
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