| 研究概要 |
グルコシルセラミド合成酵素(Ugcg)は数百にも及ぶスフィンゴ糖脂質(GSLs)分子の合成過程において最初にグルコースをセラミドに転移する最も重要な酵素の一つで,その完全欠損は胎生期致死に至る。しかし,ヘテロ接合体が無症状に見えることからUgcg遺伝子機能の解析は容易でない。この問題を克服するために,内在性Ugcg遺伝子をダブルノックアウト(DKO)したES細胞に相同遺伝子を導入し,その発現の由来を導入遺伝子に限定することにより,完全欠損から過剰発現までUgcg発現の定量的差異に基づいて遺伝子の機能を解析する実験系の樹立を試みる。任意の発生段階,且つ異所性発現も含めた任意の組織でのUgcgの定量的発現制御を条件づけ,細胞および個体レベルで相互に関連させながら,糖鎖関連胎生期致死遺伝子の機能を定量的且つ包括的に解明する実験系として,その有用性を評価する。
Ugcg遺伝子のエクソン6-8に相同遺伝子組換えを施したES細胞を用い,ハイグロマイシン耐性遺伝子を持つUgcg遺伝子ターゲッティングベクターにより,もう一方のアリルに相同遺伝子組換えを導入しDKO-ES細胞を樹立した。一方,その細胞に数種の遺伝子(CAG-loxP-Ugcg cDNA-IRES-薬剤耐性ECFP融合遺伝子-転写終結シグナル-loxP-EYFP,及び,CAG-loxP-薬剤耐性ECFP融合遺伝子-転写終結シグナル-loxP-rtetR/VP16AD-IRES-EYFP,TREプロモータ-loxP-薬剤耐性ECFP融合遺伝子-転写終結シグナル-loxP-UgcgcDNA-IRES-EGFP)を導入して得られたクローンは,いずれも期待よりも発現が低かった。また,用いたUgcg cDNAに変異が検出されたことから,導入遺伝子の構築及びその発現クローンの樹立を再度試みる必要がある。
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