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本研究は、DNA二重鎖切断修復に関わるヌクレアーセArtemisの細胞内動態解析を行うことで、Artemisの機能調節機構を明らかにすることを目的とする。研究代表者はartemis欠損DT40細胞株を作製しており、この欠損細胞株でのヒトArtemisとGFPの融合タンパク質(Artemis-GFP)の安定発現細胞を樹立した。
平成20年度の解析では、見込みに反して樹立したArtemis-GFP安定細胞のフォトブリーチング解析が困難であることが判明した。このため、本年度は広島大学原医研・田代聡教授と共同研究を行い、紫外線レーザー(364nm)マイクロ照射法により、Artemisの動態解析を行った。条件検討の結果、ヒト繊維芽細胞にヒトArtemis-GFPを一過性に導入し、この細胞に局所レーザー照射によりDSB DNA損傷を誘発させると、DNA損傷部位へのArtermisタンパク質の集積が観察でき、解析が可能となった。この系を用いて、DNA損傷部位への集積にArtemisのどの機能ドメインが必要か、検討した。Artemisのヌクレアーゼ活性は必要ではなく、複数のリン酸化部位が関与することがわかった。リン酸化酵素阻害剤であるカフェインで細胞を処理するとArtemisの集積は阻害され、上の結果を支持する。一方、Artemisのリン酸化部位は我々が以前放射線感受性の相補性テストで見出していた10個のリン酸化部位変異をもつ変異Artemisタンパク質がDNA損傷部位へ集積できることが今回の解析で判明した。このため、Artemisのリン酸化部位の見直しを行い、さらに、2個のリン酸部位に変異を持つ変異Artemisを作製し、検討した。この変異Artemisは、DNA損傷部位への集積が著しく阻害されることを見出した。
平成21年末に、京都大学放生研に共焦点レーザー顕微鏡が整備された。この機種は405nmのレーザーを搭載しており、上の広島大学の364nmレーザーとは異なる。ヒト繊維芽細胞とヒトArtemis-GFPを用い、広島大学で行った実験を再現できる条件検討し、京大でのセットアップを行い、今後は京都大学で紫外線レーザーマイクロ照射法実験を進めることが可能となった。
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