BACベクター導入ES細胞を用いた環境評価システムの構築

2008 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20510063
• 研究機関: 立命館大学
• 研究代表者: 高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
• 研究分担者: 野瀬 俊明 株式会社三菱化学生命科学研究所, 組織再生グループ, 研究員 (70183902) ; 岡本 誉士典 立命館大学, 薬学部, 助教 (50512323)
• キーワード: 内分泌撹乱物質 / ES細胞 / 細胞分化 / Bacベクター / 環境分析

研究概要

ヒトvasa遺伝子を含むBACクローンにRed/ET Recombination systemを使用してエクソンにRFP(赤色蛍光蛋白)発現カセット、薬剤耐性遺伝子を組込んだ。このベクターを制限酵素で直線化し、マウス、およびサルES細胞への導入を行い、薬剤耐性クローンを複数選抜した。それぞれからジェノミックDNAを調整し、RFPの組み込みを指標として調べた結果、BACベクターが組み込まれたES細胞株を数クローン得た。
これらを用い、生殖細胞への分化実験を行った。生殖細胞マーカーVasaはマウスおよびサルES細胞において既に発現が認められることがわかった。マウスES細胞においてRFP発現細胞は1つのコロニーにモザイク状で存在するよりもコロニー全体が一様にRFPを発現している場合が多かった。この結果は一旦RFPを発現すると本培養条件ではその発現が維持されるためと考えられた。
単独またはBMP4生産細胞と凝集させ胚様体を形成させてRFPの発現をモニターした結果、マウスES細胞では明らかなRFPの発現が認められた。
一方サルES細胞株では少数の細胞にRFPの発現は認められるものの、分化に伴い明確な発現増加は認められなかった。BMP4生産細胞との共存下で分化実験を行った場合でも、蛍光を発現する細胞の顕著な増加は認められなかった。そこでvasaの発現をRT-PCR、および抗体染色で検出した。その結果からも顕著なvasaの発現上昇は認められなかった。以上の結果からES細胞におけるvasa発現は生殖細胞分化とは異なる可能性が示唆されるとともに、そのメカニズムの詳細な検討が必要であること、さらにサルES細胞の生殖細胞への分化条件はマウスと異なる可能性が示唆された。現在、サルES細胞の生殖細胞分化過程を把握するため、分化に伴う様々な生殖細胞マーカーの発現をRT-PCRにより解析している。

研究成果

• [雑誌論文] BMP4 induces primitive endoderm but not trophectoderm in monkey embryonic stem cells (2008)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi M., Takada T., Takahashi K., Noda Y., Torii R.
  • 雑誌名: Cloning Stem Cells 10 ページ: 495-502
  • 査読あり
• [雑誌論文] Differences and similarities in the developmental status of embryo-derived stem cells and primordial germ cells revealed by global expression profiling. (2008)
  • 著者名/発表者名: Mise N, Fuchikami T, Sugimoto M, Kobayakawa S, Ike F, Ogawa T, Tada T, Kanaya S, Noce T, Abe K.
  • 雑誌名: Genes Cells 13 ページ: 67-80
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of transcripts commonly expressed in both hematopoietic and germ-line stem cells (2008)
  • 著者名/発表者名: Mizukami T, Kuramitsu M, Takizawa K, Momose H, Masumi A, Naito S, Iwama A, Ogawa T, Noce T, Hamaguchi I, Yamaguchi K
  • 雑誌名: Stem Cells Dev. 17 ページ: 67-80
  • 査読あり
• [雑誌論文] Combined activation of methyl paraben by light irradiation and esterase metabolism toward oxidative DNA damage (2008)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Y, T. Hayashi T, Matsunami S, Ueda K, Kojima N.
  • 雑誌名: Chem. Res. Toxicol. 21 ページ: 1594-1599
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oxidative DNA damage in XPC-knockout and its wild mice treated with equine estrogen. (2008)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Y. Chou P. H, Kim S. Y., Suzuki N, Laxmi Y. R. S., Okamoto K, Liu X, Matsuda T, Shibutani S
  • 雑誌名: Chera. Res. Toxicol 21 ページ: 1120-1124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased antitumor potential of the raloxifene prodrug, raloxifene diphosphate (2008)
  • 著者名/発表者名: Okamoto Y, Liu X, Suzuki N, Okamoto K, Sekimoto M, Laxmi Y. R. S., Shibutani S
  • 雑誌名: Int. J. Cancer 112 ページ: 2142-2147
  • 査読あり
• [学会発表] BMP4はカニクイザルES細胞をprimitive endodermへ分化させる (2008)
  • 著者名/発表者名: 高田達之
  • 学会等名: 第31回日本分子生物学会、第81回日本生化学会、合同大会
  • 発表場所: 神戸国際会議場(兵庫県)
  • 年月日: 2008-12-09