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蛍光染色法により、放射性同位元素(RI)を使用せずに二次元電気泳動ゲル上のリン酸化タンパク質を容易に検出できるようになった。しかし蛍光染色試薬は、一般に高価であるうえに注目するキナーゼによりリン酸化されたものと、もともとリン酸化されていたものとを区別することはできない。RIを用いたin vitroのキナーゼアッセイは、比較的安価に行なえる上に、そのアッセイ時にリン酸化されたものだけを検出できるメリットがある。一方欠点としては、当該キナーゼ以外に混入するキナーゼ活性による、非特異的な放射能の取込みが考えられ、これをいかに排除するかがRI標識によるキナーゼ基質同定法の成否を握っている。今年度は、1)クローニングしたヒトPKD2遺伝子の下流に、緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入し、PKD2-GFPの融合タンパク質をコードするcDNAを作製し、これをレンチウイルスベクターに組込み、ヒトT細胞株Jurkatに強制発現させた。2)同時に、常時活性化型PKD2-GFPおよび不活性型PKD2-GFPを安定発現するJurkat細胞も作製した。3)これらの細胞を抗CD3抗体を用いて刺激して回収し、可溶化した後、抗GFP抗体を用いて各変異PKD2を沈降させた。これにJurkat核抽出物と放射性ATPを加えて反応させ、反応生成物を二次元電気泳動にて分離し、放射能を持つタンパク質プロットの再現性、ならびに非特異的にリン酸化されるスポットを低減させる条件検討を行なった。
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